猪塞内卡病毒A、猪水疱病毒和口蹄疫病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

2023-09-21吴志敏张馨月张添琪张嘉钰梁湘雨孟凡茹胡桂学

动物医学进展 2023年9期

关键词：检测

苏博,吴志敏,张馨月,赵涵,鲍迪,张添琪,张嘉钰,梁湘雨,孟凡茹,王开,胡桂学

(吉林农业大学动物医学院,吉林长春 130118)

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)、猪水疱病毒(Swine veslcular disease virus,SVDV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)均为小RNA科病毒[1-5],都能引起感染猪产生水疱症状[6-9],仔猪病死率较高,仅凭临床症状难以鉴别3种病毒感染猪[10-13]。已报道的引起猪出现水疱症状的病毒多为二重荧光定量检测方法[14-16]。为了实现快速鉴别有水疱症状的病毒感染猪,本试验建立一种可以鉴别3种病毒的三重荧光定量检测方法,为临床诊断鉴别提供科学方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、质粒 SVA纯培养物由四川农业大学动物生物技术中心惠赠,FMDV水疱液为确诊来自四川、重庆病猪。含有SVA、FMDV、SVDV病毒部分保守序列的重组阳性质粒由上海生工生物工程有限公司合成。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、经典猪瘟病毒(CFSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)由本实验室保存,伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆病毒环2型(PCV2)病料来自吉林省2020-2021年送检的阳性组织样本。

1.1.2 主要试剂 ProTaqHS premix probe qPCR kit和ROX reference dye (4 μmol/L),Accurate公司产品;DEPC treated water、Trizol,Sangon公司产品;2×EsTaqmaster mix(dye),CWBIO公司产品;反转录试剂盒、DNA Marker DL 1 000、6×Loading buffer,TAKARA公司产品;病毒DNA提取试剂盒,OMEGA生物技术公司产品;50×TAE,Coolaber公司产品;Gel red,Bio sharp公司产品。

1.1.3 主要仪器 Applied biosystemTM7500荧光PCR仪和Nano Drop微量核酸蛋白浓度测定仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品;EP Mastercycler nexus PCR仪和台式高速冷冻离心机,Eppendorf公司产品;凝胶成像系统,Bio red公司产品。