培养基平板随机染菌原因分析及控制方法

2023-09-18张利军杨丽丽

科技创新与应用 2023年26期

陈静，张利军，王娟，杨丽丽，兰坤

（郑州安图生物工程股份有限公司，郑州 450016）

培养基平板随机染菌即在工业生产过程中所用物料、设备均合格情况下因人员操作、环境等因素影响有少量的菌落入培养基，导致极少数平板表面有菌落生长的现象。培养基平板作为鉴定、分离、纯化菌种的重要工具，若工业生产过程受到杂菌污染，必然会造成人力、试剂的浪费，降低生产效率及收益；除此之外，终端使用可能会造成误判、影响结果观察等后果，因此，其生产过程中随机染菌的控制至关重要。

1 培养基平板生产工艺简介

培养基平板的生产工艺流程如图1 所示，其生产过程除自动化设备之外仍需手工操作，例如培养皿的拆袋准备、灌装后的平板转移等工作内容均需要人工去完成，加之培养皿并非密封状态，各工序的手工操作均会带来染菌的风险。因此，防止染菌、降低染菌率是发酵生产中一项长期、重要的工作。

图1 培养基平板生产工艺简图

2 随机染菌原因分析及控制措施

为了有效地控制染菌，就必须查找出造成染菌的真正原因，然后才能对症下药，针对性地防止和避免。造成发酵染菌的因素很多，根据自己在培养基平板多年的生产实践与管理经验，认为主要是以下4 个方面。

2.1 人员管理

首先，思想上要高度重视，操作上要一丝不苟。由于思想不重视，操作上产生染菌的因素也很多[1]。其次也要关注人员技能方面，每个人需要具备接受新知识、新事物的能力，并会举一反三提升自己的无菌意识，只有这样控制随机染菌才能事半功倍。

从平板生产工艺流程图中可以看出，培养基平板生产过程多个工序均需手工直接接触平板，比如准备无菌空平皿、转移平板等操作需严格按照作业指导书执行，否则就会增加产品的随机污染。因此，针对人员控制方面可以参照表1。

表1 人员管理关键要点

平板的生产过程工序多，因此需要多人协作、共同完成，管理人员除了关注个人素质，还需考虑不同员工的性格、特点、工作习惯等因素，综合考虑人员搭配问题。

各岗位、各操作人员都要切实树立无菌观念，以一丝不苟的态度对待并执行，方可对减少随机染菌起到关键作用。

2.2 生产环境控制

《医疗器械生产质量管理规范体外诊断试剂现场检查指导原则》（以下简称《检查指导原则》）中规定应当根据体外诊断试剂的生产过程控制，确定相应级别的洁净室内进行生产的过程，避免生产中的污染。酶联免疫吸附试验试剂、免疫荧光试剂、免疫发光试剂、聚合酶链反应试剂、金标试剂、干化学法试剂、细胞培养基、校准品与质控品的配制及分装等产品的配液、包被、分装等，生产区域应当不低于100 000 级洁净度级别。无菌物料等分装处理操作，操作区域应当符合局部100 级洁净度级别。

工业生产中培养基平板的生产过程是在10 000级洁净厂房内进行的，同时使用超净工作台提供局部无尘无菌工作环境的单向流行空气净化设备，为无菌培养基的分装过程提供了局部100 级的洁净级别。这样的环境级别为无菌产品的生产提供了基础与保障。

尽管如此，人体与外界环境才是最大的污染源，尤其是在炎热的夏季，外界环境的微生物含量更多，更容易随着人员、物品进入车间时被带入洁净区，污染洁净区的环境，影响产品质量。

因此，日常的环境监测尤其重要，通过监控车间环境变化，对环境数据进行分析，及时采取相应的控制措施。主要监控的项目有尘埃粒子数量、浮游菌、沉降菌和静压差等，其中洁净室空气洁净度级别应当符合相应规定，具体见表2。

结合洁净车间内日常环境监测数据，并连续跟踪3 个月（12 周）的培养基平板每周染菌率（图2），发现洁净车间的环境较差时培养基平板染菌率会有所升高，结合培养基平板生产工艺及生产过程的操作进行分析，当平板生产环境洁净度级别较低时，环境中的微生物容易附着在平板边缘位置，进而进入平板内部污染培养基，因此控制平板生产环境的洁净度级别对于平板的染菌率来说至关重要。

图2 每周环境指标与其染菌率

洁净车间的空气是经过高效过滤器过滤后进入的，并且《检查指导原则》要求空气洁净级别不同的洁净区之间的静压差应当大于5 Pa，洁净区与室外大气的静压差应大于10 Pa，并应当有指示压差的装置。因此可以保证送入洁净区的空气是经过过滤的，并因压差梯度的存在，外界空气无法自然进入洁净区，所以洁净区的环境遭受污染必然是通过人员、物流通道将外界空气、污染物带入洁净区的。

第一，洁净车间的设计应当合理、不会影响洁净区内的洁净度，人流通道、物流通道应分开，并设置缓冲间，避免非洁净区与洁净区之间的交叉污染。

第二，日常微生物检验工作的无菌环境可包括无菌室、超净工作台、生物安全柜和火焰周围。标准的无菌室要求设有缓冲室、空气过滤、墙面、墙角、相关操作设备和紫外灯等[2]。同样的，工业生产过程中物品进入洁净厂房也需要一系列的处理。

第三，对于人员进出洁净车间：首先员工需注意个人仪表、注意清洁个人卫生，进入车间前先按照标准六步洗手法洗手，随后遵循遮掩口鼻、完全包裹头发、领口袖口扎紧等原则穿戴洁净服及工作帽，彻底手部消毒后方可进入洁净厂房。

第四，对于物品、物料进入洁净区，需要保证物品已经过辐照或其他消毒方式处理，如有外包/外箱包裹的，在物流入口的缓冲间需去掉外包/外箱，然后转移至物流入口房间内，随后由洁净区内人员进入房间并取走。

工业生产过程中所需要的物品可以分为两大类，分别是无菌物品和非无菌物品。①无菌物品，例如塑料培养皿等物料、容器具、清洁毛巾等，均要提前经过辐照、高温高压蒸汽灭菌处理，然后将灭菌后的物品转移至物品通道，拆除外包装后将无菌物品转移至缓冲间，才可进入洁净厂房；②非无菌物品，例如纸质记录及文件、因临时需要传入车间的工具等，可在洁净车间外使用移动式臭氧消毒柜先熏蒸30 min 后进入物品通道缓冲间，再经过风淋60 s 后才可进入洁净车间使用。

其中，对于无菌物品需明确规定其使用有效期，需要在规定的效期内使用，并设置专一存放无菌物品的区域，避免其他人员或物品污染。

第五，洁净厂房日常维护。日常工作过程中需要保持车间整洁，暂存的垃圾需及时清除，避免细菌滋生；洁净厂房需定期清洁消毒，可采用空气消毒和表面消毒相结合的方式，空气消毒常用紫外照射法、臭氧熏蒸法、环氧乙熏蒸等，表面消毒包括桌面、地面、墙面等表面，可使用规定浓度的84 消毒液、百毒杀消毒液、新洁尔灭消毒液等搭配毛巾进行表面擦拭消毒。紫外线与臭氧对环境消毒效果好，且使用灵活简便，对人体的伤害较小。夏季、高温高湿的环境下污染率较高，要求培养室的相对湿度应控制在70%以下[3]。

第六，洁净车间在正常运行的情况下，洁净区内环境变差，肯定是人流、物流2 个通道引入了微生物，因此对于人员、物品进出洁净区进行控制时，除了规定人员、物品本身的防护、消毒控制措施，还应关注人流通道与物流通道的清洁消毒，因为人员、物品通过对应的通道进入洁净区的过程必定会将外界微生物引入，因此为了避免人员、物品通过对应的通道进入洁净区的时候带来污染，应当对人流、物流通道增加清洁消毒，可以实行每天下班前或上班前使用消毒液拖地、表面消毒，这样就可以保证人流、物流通道的持续性洁净。

综上，想要控制洁净区的洁净环境，则需要从人员进出、物料传入、日常监控与维护3 个方面做一些工作，对洁净区的环境加以防范与预防。

2.3 生产工艺过程控制

上述生产环境控制中提到培养基平板的灌装在局部无尘无菌的环境下进行，但是在实际工业生产中只有将培养基灌入培养皿内的过程是在局部100 级环境下进行的，其他过程，例如培养皿的拆袋准备、设备到桌面的转移等工序仍需要人工去完成。因此需要制定较为详细、具体的生产工艺要求。生产无菌制品，无菌操作技术至关重要。

生产操作过程中，拿取无菌物品，手部必须经过消毒。未经消毒的手、臂均不可直接接触无菌物品或者超过无菌区取物。关于无菌物品的管理，必须保存在无菌物品区域，不可交叉。

如图3 所示，在某一年的8 月曾出现多批次平板随机染菌，菌落位置多数在培养基表面边缘，经过排查设备、生产过程、人员操作，发现平板的生产过程存在操作不当问题，具体表现为操作人员转移平板期间操作不当导致培养皿的盖、底分开，造成培养基边缘有菌落生长，因此在制定各项操作工艺时需要结合实际情况，并加大工艺管理、监督力度，提前发现风险、识别风险并加以改进。同时要持续跟产并考察操作人员。

图3 月度产品染菌率

2.4 设备管理

培养基平板工业生产过程中也需依靠自动化设备完成，因此设备的运行状况是影响培养基平板随机染菌的主要因素之一。前期对于设备的选型、设计都至关重要，需要避开清洁死角等问题。在工业生产中，需要识别设备清洁死角，针对性地制定清洁工艺；培养基平板的灌装过程会在层流罩中进行，也需要检查轨道的密封性，保证局部100 级的洁净环境。

在工艺过程管理中，要制定管理标准，加强对设备等的定期检查力度，每月进行检查、维修，发现问题及时解决；制订岗位培训计划，对员工定期进行各项规章制度、岗位操作规程及相关文件的培训，并严格遵照执行[4]。

除此之外生产设备的变化需要重点关注，如图4所示，在某年4 月份产品月度染菌率异常升高，究其原因发现因产能扩大，生产部投入一台新的平板灌装设备，新设备投入使用期间存在磨合期，设备卡顿、故障频发，此时操作人员人为干预设备运行，增加了平板随机污染的风险。经过磨合及设备维修人员调试，新设备趋于稳定，随即产品的月度染菌率逐步下降。