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基于电导率-含水量曲线法制备、优化广藿香挥发油微乳的研究*

2023-09-13钟文嘉黄益穗刘灼波

中医药导报 2023年8期
关键词:微乳临界点挥发油

钟文嘉,黄益穗,刘灼波

(广州中医药大学第一附属医院,广东 广州 510405)

广藿香挥发油是广藿香的主要药用有效成分[1],具有芳香化浊、解暑的功效[2]。现代药理学表明,广藿香挥发油具有抗菌、抗炎、调整胃肠运动功能等作用[3]。由于广藿香挥发油具脂溶性,口服入药难于在胃肠道被吸收,制成微乳制剂(O/W型)可改善其在胃肠道的吸收性,从而提高生物利用度[4]。微乳制剂是由一定比例的油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂配制而成的热力学稳定体系,其粒径一般介于10~100 nm之间。要获得稳定性好的O/W型微乳,找准O/W型微乳成型临界点尤为重要。目前的报道[5-6]多为目测法,即肉眼观察体系由混浊至澄清作为O/W型微乳成型临界点;也有报道[7-9]提到建立电导率-含水量曲线法,以电导率最大值时对应的含水量值作为O/W型微乳成型临界点,但是没有采用更为直观的指标来证实电导率-含水量曲线法的精确性。本研究基于此背景,分别采用目测法、电导率-含水量曲线法确定微乳的O/W型微乳成型临界点,按各自获得的临界点分别配制微乳,通过比较平均粒径、多分散系数(polydiseperse Index,PDI),证实电导率-含水量曲线法比目测法确定的O/W型微乳成型临界点更为精确,并在此基础上,使用该方法制备并优化广藿香挥发油微乳,以期为中药微乳制剂的工业化发展提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Zetasizer Nano ZS90型纳米粒径电位分析仪(MALVERN公司);HT7700型透射式电子显微镜(HITACHI公司);MS603S型天平(美国梅特勒-托利多公司);二级反渗透纯化水制水机(广州万冠制药设备公司)。

1.2 试药 广藿香挥发油(批号:P905696-23)、肉豆蔻酸异丙酯(IPM)(批号:1811858)均购于上海麦克林生化科技有限公司;油酸(OA)(批号:20220120)、吐温80(TW80)(批号:20211201)、聚乙二醇400(PEG400)(批号:20211215)、1,2-丙二醇(批号:20210901)、无水乙醇(批号:20211201)均购于天津大茂化学试剂厂;聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)(批号:2022032038R)购于广东翁江试剂公司;所有试剂均为分析纯,药用级别纯化水等。

2 方法与结果

2.1 目测法和电导率-含水量曲线法制备空白微乳和广藿香挥发油微乳 从预试验筛选出3个稳定的空白微乳处方,分别制备3个空白微乳和3个载药微乳。(见表1)(1)电导率-含水量曲线法:以处方3为例,将助表面活性剂、表面活性剂先混匀,再加入油相,在500 r/min转速下磁力搅拌10 min,获得4 g的微乳原液,然后加入0.2 g的纯化水,搅拌20 s后,测电导率值并记录,重复上述操作步骤,直至测得微乳含水量80%时电导率值,将得到的微乳含水量值、对应的电导率值,使用软件Origin 2021绘制电导率-含水量曲线,将电导率获得最大值时,对应的含水量值作为O/W型微乳成型临界点。(见图1)(2)目测法:将助表面活性剂、表面活性剂先混匀,再加入油相,500 r/min转速下磁力搅拌10 min,获得4 g的微乳原液,然后慢慢加入纯化水,搅拌,观察微乳状态,重复上述操作,直至微乳由混浊状态变为澄清,记录加入纯化水的质量,此时微乳的含水量值即为O/W型微乳成型临界点。

图1 处方3 空白微乳、处方6 载药微乳的电导率-含水量曲线图

表1 空白微乳和载药微乳处方组成、配比

上述两种配制方法,由3名操作人员单独进行,将获得的实验结果取平均值,作为目测法和电导率-含水量曲线法的O/W型微乳成型临界点,然后进一步比较两种方法制备的微乳的平均粒径和多分散系数(PDI)。由于单独使用广藿香挥发油作为油相取代处方1、2的OA、处方3的IPM,均不能获得稳定的微乳(出现混浊、分层);将广藿香挥发油与OA、广藿香挥发油与IPM按质量比2∶1混匀后,作为混合油相,按表1处方1、2、3的配比,获得微乳的平均粒径、PDI偏大,稳定性一般;将广藿香挥发油与OA、广藿香挥发油与IPM按质量比1∶1混匀后,获得微乳的平均粒径、PDI均较小,稳定性较好,故选定该比例作为混合油相,备用。

2.2 目测法和电导率-含水量曲线法结果对比 依据“2.1”项表格的处方单独进行,将获得的实验结果取平均值,作为目测法和电导率-含水量曲线法的O/W型微乳成型临界点。各取两种方法获得的微乳适量,稀释100倍后测量平均粒径、PDI,实验结果见表2。结果表明,目测法测得的O/W型微乳成型临界点普遍靠前,在该临界点下测得微乳的平均粒径、PDI比电导率-含水量曲线法偏大,将处方1~6微乳各取适量,分别滴入亚甲基蓝试剂和苏丹Ⅲ试剂,静置观察,可见上述微乳中,亚甲基蓝试剂的扩散速度均明显大于苏丹Ⅲ试剂,表明上述微乳类型均为O/W型。该实验证实了目测法和电导率-含水量曲线法均能对O/W型微乳成型临界点有较准确的判断,但是电导率-含水量曲线法精确度更高,获得的微乳更为稳定,证实了目测法确定的O/W型微乳成型临界点,体系可能处于W/O型和O/W型双连续相转变为O/W型的最后阶段[10-11],尚未完全转变为O/W型。该结果也进一步验证了电导率-含水量曲线法确定的临界点比目测法更为精确。

表2 目测法、电导率-含水量曲线法检测结果

2.3 工艺筛选

2.3.1 电导率-含水量曲线法制备工艺的设定 将广藿香挥发油分别与OA、IPM按质量比1∶1的比例混匀,作为油相备用,选取预试验中筛选出的RH40、TW80 作为表面活性剂,PEG400、1,2-丙二醇、无水乙醇作为助表面活性剂。选择在室温(25 ℃)下进行试验,首先使用磁力搅拌器在500 r/min转速下将表面活性剂和助表面活性剂按照固定质量配比Km值(Km值=表面活性剂/助表面活性剂)为2∶1混匀,再按(含药油相/总表面活性剂)质量比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,在500 r/min转速下搅拌10 min制成微乳原液4 g,然后加入0.2 g纯化水,搅拌20 s,测电导率,再加入0.2 g纯化水,搅拌,测电导率,直至体系含水量为80%时,将获得的含水量、电导率值输入Origin 2021绘图,建立电导率-含水量曲线,将电导率最大时的含水量值作为O/W型微乳成型临界点,对于不能成乳或者成乳后平均粒径未在10~100 nm范围的处方予以剔除;此外,部分微乳成乳后,静置24 h又重新出现混浊,这类处方也予以剔除;最后,根据油相、总表面活性剂、水相的占比,使用Origin 2021软件给合格的微乳处方绘制伪三元相图。

2.3.1.1 油相、表面活性剂、助表面活性剂类型的选定 按“2.3.1”项的方法,将不同类型的油相、表面活性剂、助表面活性剂一一组合,按照固定配比Km为2∶1,混合油相、总表面活性剂质量比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,配制微乳,将合格的微乳处方绘制伪三元相图。结果显示,图2D的微乳成乳区域最大,故选定广藿香挥发油/IPM作为含药油相,TW80作为表面活性剂、PEG400作为助表面活性剂,用于下阶段Km值的筛选。(见图2)

图2 不同微乳处方的伪三元相图

2.3.1.2 Km值的选定 按“2.3.1”项的方法,将微乳处方广藿香挥发油/IPM,TW80、PEG400,选定Km为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1,含药油相、总表面活性剂质量比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、6∶4、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,配制微乳,筛选Km值。结果显示,当Km值为3∶1时微乳成乳区域最大。(见图3)

图3 不同Km 值的伪三元相图

2.3.2 单因素试验“2.3.1.1”项和“2.3.1.2”项筛选结果表明,含药油相与总表面活性剂质量比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4时,可获得合格微乳,含药油相与总表面活性剂质量比为7∶3、8∶2、9∶1时不能配制成乳,故选定含药油相占比最小为10%,最大为60%(即广藿香挥发油占比5%~30%)用于下一阶段响应面法工艺筛选;“2.3.1.2”项筛选结果表明,表面活性剂与助表面活性剂质量配比Km值为2∶1、3∶1时可获得较大的微乳成乳区域,当Km值为4∶1或1∶1时微乳成乳区域明显变小,说明上述两种质量配比下,不能获得较大的含药油相占比(微乳载药量)。当Km值>4∶1或Km值<1∶1时,微乳成乳区域会进一步缩小,因此选定最大Km值为4∶1,最小Km值为1∶1进行下一阶段响应面法工艺筛选。试验过程中发现磁力搅拌器转速的不同,对微乳的成乳效果有一定的影响,为了考察磁力搅拌器转速对微乳成乳效果的影响,采取固定含药油相与总表面活性剂质量比为1∶9、Km为3∶1,考察磁力搅拌器转速对微乳成乳效果的影响。结果发现,磁力搅拌器转速低于500r/min时成乳时间较长,且搅拌不够均匀,不利于后续微乳的配制。当磁力搅拌器转速高于1 100 r/min时,过高的转速带动了烧杯的转动影响了搅拌效果,且过高的转速有可能将空气带入,制得的微乳有气泡分散在体系中。基于上述原因,选定磁力搅拌器转速为500~1100 r/min。

2.3.3 响应面法工艺筛选[12-13]

2.3.3.1 响应面法考察因素 按“2.3.2”项的结果制定响应面法考察因素水平表。(见表3)

表3 响应面法考察因素水平表[14-15]

2.3.3.2 方案设计及结果[16]使用软件Design-Expert 12.0对表3进行响应面法设计,统计结果,见表4。

表4 工艺和结果

对表4的获得的结果进行平均粒径、PDI的方差分析,见表5~6。结果显示,平均粒径、PDI获得的数学模型均为极显著性,且失拟项不具显著性,表明上述数学模型模拟的情况较为准确[17-18]。显著因素广藿香挥发油(%)、Km对粒径、PDI响应面分析见图4。平均粒径、PDI取最低值时拟合方程分别为:平均粒径=27.230+5.790A+1.875B-0.426C+2.905AB-0.688AC+1.835BC-2.912A2+2.105B2+0.344AC2;PDI=0.102+0.037A+0.024B+0.005C+0.039AB+0.001AC+0.015BC-0.006A2+0.044B2-0.001C2。由于平均粒径对微乳体系的影响更为重要,故选择最小平均粒径对应的点作为最优处方点,即广藿香挥发 油 为10.07%、IPM 为10.07%、TW80 为60.43%、PEG400 为19.43%,Km为3.11,搅拌速率为622 r/min,获得的平均粒径理论值为17.64 nm,PDI为0.069。

图4 广藿香挥发油、Km 对平均粒径、PDI 的响应面图

表5 平均粒径的方差分析

表6 PDI 的方差分析

2.3.3.3 最优工艺验证 对“2.3.3.2”获得的最优点进行3批次验证。结果显示,平均粒径、PDI值和模拟结果非常接近,说明此处方筛选结果可靠。(见表7)

表7 最优工艺验证

2.4 微乳的理化性质及稳定性考察

2.4.1 微乳的电镜图 取“2.3.3.3”项微乳适量滴至铜网上,静置10 min后,使用滤纸吸干,再加入2%的磷钨酸负染10 min,再用滤纸吸干剩余液体,置于电镜下观察。图片显示微乳外观饱满、圆整,稳定性较好。(见图5)

图5 微乳的形态

2.4.2 高速离心考察 将微乳于5 000 r/min转速下高速离心30 min。结果显示,微乳依旧澄清、透明,未见分层,表明微乳稳定性好。

2.4.3 微乳类型鉴定及25 ℃下遮光、不遮光考察 取“2.3.3.3”项微乳适量,分别滴入亚甲基蓝和苏丹Ⅲ试剂,静置5 min。图6A、6B显示,亚甲基蓝在微乳中的扩散效果明显,而苏丹Ⅲ停留在液面几乎不扩散,表明该微乳为O/W型,再取“2.3.3.3”项微乳适量,在室温(25 ℃)条件下,分别作遮光处理和不作遮光处理,放置60 d后测平均粒径、PDI,试验平行3次。图6C、6D显示,两种状态下微乳的颜色无明显差异;遮光状态下,测得微乳的平均粒径为(19.23±0.26)nm、PDI为(0.085±0.005);不遮光状态下,测得微乳的平均粒径为(19.47±0.31)nm、PDI为(0.089±0.009)。试验结果进一步证明,在25 ℃下,微乳放置60 d后平均粒径、PDI虽略为增大,但依旧稳定。

图6 不同状态下微乳的外观

3 讨 论

笔者查阅文献[19]发现可使用渗滤电导模型理论解释微乳的电导率-含水量曲线变化规律。以图1为例,微乳原液阶段,由于含水量为0,油的导电性又极低,此时电导率接近0。随着含水量的增加,体系间连续相依旧为油相,故电导率的增加较为缓慢。当含水量到达渗滤阈值[20](渗滤阈值:导电微粒占整个体系的体积分数)后,带电液滴增加明显,故电导率增加迅速,此时体系为W/O型;随着含水量的进一步增加,微乳液滴与液滴之间发生碰撞,形成了导电链,微乳的电导率又进一步增加,直至电导率的顶点,此范围的微乳为W/O型和O/W型双连续型。当微乳的电导率到达顶点后,含水量的增加又稀释了带电的微乳液滴,从而电导率开始下降,此时体系转变为单一的O/W型。该理论可以有效解释微乳电导率的变化与微乳的相间关系,但是之前的报道没有采用直观的方式来证实该理论的可靠性,而本研究则通过拍摄微观状态下微乳的形态验证了该理论的可靠性。此外,试验过程中发现搅拌速率对微乳的成乳有一定的影响,但是实际筛选结果却并不显著,因此,微乳的搅拌速率适中即可,太快可减少乳化时间,但容易带入空气,太慢则成乳时间过长,或难于配制成乳。再者,适当增加微乳的载药量可减少服药量,但是载药量不宜一味增大,试验过程中发现微乳载药过大容易造成平均粒径增大破坏其稳定性,甚至出现分层、变混浊的现象,因此,要扩大中药微乳制剂,还须提高中药精制、提纯技术方可实现。本研究通过测定平均粒径、PDI及生物透射电镜观察的手段验证了电导率-含水量曲线法中电导率最大值作为O/W型微乳成型临界点的精确性,可以为中药微乳制剂的制备提供一定的参考。

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