黄亨良

兴义市南盘江镇农业农村服务中心，贵州兴义 562400

0 引言

奶牛乳房炎不但可导致奶牛产奶量下降、淘汰率增加[1]，而且治疗费用高昂。数据显示，由于治疗诊断费、劳动成本和废弃奶等原因造成的平均损失达444 美元/头·年，其中治疗费用损失达128 美元/头·年[2]，给牧场带来巨大的经济损失。奶牛乳房炎在全世界的发病率较高，如北马其顿共和国高产奶牛乳房炎发病率达到68.6%[3]，孟加拉乳房炎发病率达43.9%[4]。

目前，引发奶牛乳房炎的病原菌主要分为环境型病原菌和传染型病原菌[5]。环境型病原菌是指由于奶牛居住环境差而产生的病菌，是引起临床乳房炎的主要病原菌，主要为杆菌和链球菌类[6]。传染型病原菌是指可以在牛群之间或乳房之间广泛传播的病菌，主要为金黄色葡萄球菌和停乳链球菌[7]。

奶牛摄入营养不足、生活环境卫生差或处于高温高湿环境时，极易由于免疫力下降而被病原菌感染，而引发乳房炎[8]。而且产奶量和乳房炎发病率呈正比[9]，高产奶牛的发病率远高于普通奶牛。

除了提高营养和改善奶牛饲养环境外，机体增强免疫力是降低乳房炎发病率、维持奶牛机体健康水平，增强生产性能的重要措施。其中天然免疫是机体免疫屏障的第1道防线，主要包括对病原菌的识别，早期细胞因子的合成，补体的产生及自噬的发生[10]。因此，增强天然免疫基因的筛选，有助于从分子水平上改善奶牛免疫力，抑制乳房炎发病率，降低牧场的经济损失。

1 奶牛乳房天然免疫系统的构成

奶牛乳房的天然免疫系统主要由皮肤组织、乳头管、体液和免疫细胞构成[11]。皮肤组织对防御外界病原菌直接入侵体内起主要作用。乳头管在非挤奶期和奶量较少时都关闭，形成将病原菌隔离在外的物理屏障。体液中能发挥免疫功效的分子主要为补体、溶菌酶、乳铁蛋白、抗体和转铁蛋白等；细胞则主要为巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞、乳腺上皮细胞和树突细胞等[12]。奶牛乳房部位受到病原菌入侵感染时，巨噬细胞和乳腺上皮细胞部位的模式识别受体（TLR和CD14等）会接收到病原菌的特征信号，从而激活体内的NF-κB或AP-1信号通路，产生相应的炎症因子和趋化因子。其中炎症因子IL-1β和TNF-α等会将体内的炎症信号加大，加剧炎症反应。而趋化因子则起到“定位”作用，促使更多白细胞尤其是中性粒细胞进入感染部位，杀死入侵的病原菌[13]。病原菌不同，引起的免疫反应强度存在差异。通常革兰氏阴性细菌会引起较强的免疫反应，导致明显的临床症状，而机体免疫反应也较迅速，能及时处理病原菌后恢复正常状态；革兰氏阳性细菌引起的免疫反应较弱，持续时间久，机体无法将这类病原菌很快清除干净，可引起乳房部位持续炎症，造成较大危害[14]。

2 奶牛抗病相关基因

近年来，为了提高产奶量，通过分子选育技术对高产奶牛进行基因筛选的研究较多，但对增强奶牛抗病能力基因的研究较少，仍处于起步阶段。根据分子生物学实验和流行病学调查，不同品种的奶牛对结核杆菌和布鲁氏杆菌的抵抗能力存在基因水平上的差异[15，16]，其中瑞士褐牛比荷斯坦牛巨噬细胞的活性氮自由基合成能力更强，对沙门氏菌的吞噬清除能力更强[17]，为通过分子选育，降低奶牛乳房炎患病率提供了依据。除了将抗菌能力作为筛选基因的检测指标外，牛奶中体细胞数也能够体现出乳房炎的严重程度，研究者通常会将体细胞数的变化作为筛选抗病基因的一项重要指标[18]。目前研究发现能影响奶牛机体免疫力的候选基因主要为以下几种。

2.1 模式识别受体基因

模式识别受体（Pattern Recognition Receptor，PRR）是奶牛机体内感应外来病原菌入侵的重要受体[19]。特别是肽聚糖识别蛋白和溶菌酶家族是两种特别重要的PRR，能对病原菌中的肽聚糖进行特异性识别，从而在防御和抵抗病原菌入侵等方面起重要作用[20]。王洪亮[21]利用基因组DNA扩增肽聚糖识别蛋白基因序列，并检测序列中的多态位点，发现调控肽聚糖识别蛋白的PGLYRP1基因表达后，对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌有较好的抑制作用。Gao等[22]通过高通量测序发现，通过调节H与溶酶体表达的HSPA8基因的表达能够降低乳房炎的炎症。此外，Toll样受体也是PRR家族中和免疫相关的重要靶点。Russell等[23]在TLR1基因上发现1 个与奶牛临床乳房炎显著相关的SNP位点，且通过细胞试验发现，不同基因型奶牛产的牛奶中体细胞表面的TLR1受体的表达量存在差异，其中CG基因型奶牛的表达量显著低于其他基因型的奶牛。不仅如此，Sharma等[24]也在TLR4上发现3 个与奶牛体细胞数显著关联的SNP位点。刘娟[25]发现TLR1基因的G1498A位点与奶牛的乳脂率、体细胞数和乳房炎发病率显著相关。CD14是存在于白细胞表面的PRR，能识别外来病原菌的表面抗原脂多糖。有研究发现，CD14的SNP基因型1908AG外显子上一个错义突变就能改变CD14受体在嗜中性粒细胞的表达量，从而增强对病原菌的识别和灭杀作用，这说明CD14可能是影响奶牛免疫力的候选基因之一[26]。CARD15（NOD2）也是胞内的PRR，参与机体的炎症反应，研究发现，牛CARD15编码区的3020碱基发生错义突变后对体细胞数具有较大影响，因此也被认为是乳房炎的候选基因之一[27]。

2.2 趋化因子及其受体基因

趋化因子是一种具有诱导免疫细胞进行定向趋化能力的细胞因子，能够调节免疫反应。奶牛被病原菌入侵后，白细胞能通过表面的受体CXCR1和CXCR2基因识别感染部位释放的趋化因子——白介素-8（IL-8），引导自身向受感染部位移动，吞噬并杀死病原菌[28]。其中关于CXCR1基因的研究最多。CXCR1基因的+777位点的错义突变会导致谷氨酰胺和组氨酸之间发生替换，而该位点与荷斯坦牛的临床乳房炎和亚临床乳房炎密切相关[29]。该基因的-1768位点与泌乳期奶牛的体细胞数显著关联[30]；+735位点与临床乳房炎的发病显著关联[31]；+777位点与中国荷斯坦牛的体细胞数显著相关，可作为奶牛亚临床乳房炎抗性基因的分子辅助标记[32]。张亚琴[33]通过研究中国荷斯坦牛的CXCR1和IL-8两个基因多个突变位点多态性与乳房炎易感性的交互作用，发现CXCR1基因的-1830位点、-1768位点和IL-8的2789/2862位点的三者交互模型为奶牛乳房炎易感性相关的最佳选择模型。

2.3 炎症因子及其受体基因

奶牛乳房炎常伴随长时间炎症，因此，炎症细胞因子及其受体基因也是影响乳房炎的重要因素，如TNF-α和IL-1β等炎症因子能放大炎症信号，增强机体的免疫应答反应[34]。Verschoor等[35]在奶牛的IL-10及其受体IL-10Rα基因上分别发现10 个和6个相关基因位点，其中IL-10Rα上的SNP1185C＞T位点与奶牛的体细胞数密切相关。Skelding等[36]对IL-12的IL12RB1/B2和IL-23受体基因的启动子和外显子区测序，发现与乳房炎相关的10 个SNP位点。杨宇泽等[37]发现，牛整合素（ITGB2）基因的389C＞T位点的基因型与乳脂肪率、乳蛋白率和乳房炎相关，其中ITGB2基因389位点和774位点的TTCC的复合基因型可用于中国荷斯坦牛乳房炎抗性和乳品质的潜在分子标记。Günther等[38]发现，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，都能刺激乳房上皮细胞产生趋化因子，但在介导的炎症反应过程中，大肠杆菌通过上调TNF-α和IL-1β的表达来产生快速炎症，而金黄色葡萄球菌通过IL-6的生成来诱导炎症反应。

2.4 抗菌肽相关基因

抗菌肽是一种能直接杀死病原菌的活性多肽，在奶牛机体中，能表达产生抗菌肽的相关基因对降低奶牛乳房炎的患病率具有重要作用[39]。其中乳铁蛋白基因启动子和编码区域序列呈高度多态性，具有较好应用前景，是潜在乳房炎的相关候选基因。李宏滨[40]通过基因组学分析对照β-防御素、AHCY（S-腺苷高半胱氨酸水解酶编码基因）和MPIF-1（骨髓细胞前体抑制因子 1 基因）3 种基因与奶牛乳房炎症的关联性，经过3D结构分析发现，β-防御素是一种存在于乳房上皮细胞表面、具有微生物菌落抗性的活性抗菌肽。王静[41]通过重叠延伸PCR克隆了重组LAP-CATHL2抗菌肽，发现其对由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有良好的治疗作用。李云龙等[42]针对奶牛溶菌酶的多态性和乳房炎的相关性进行研究，检测420 头奶牛的溶菌酶基因，发现其外显子的115位点上存在突变，且该位点与体细胞数和305 天产奶量具有较大的关联，可用于奶牛乳房炎抗性和产奶量的分子标记。

2.5 其他相关基因

闫涛涛等[43]发现，乳房炎奶牛干扰素调节因子5（IRF5）的表达量比正常奶牛显著上升，可能是通过与白细胞介素-1受体相关激酶、组蛋白乙酰转移酶p300、C-C基序趋化因子4等蛋白相互作用，调节炎症的发生概率。吴培等[32]对奶牛亚临床乳房炎抗性的多种基因进行体细胞数的关联性分析，结果发现，SPP1的-1301位点、CXCR1的+777位点、NOD2c.4500位点与中国荷斯坦牛体细胞数显著相关，可作为奶牛亚临床乳房炎抗性基因的分子辅助标记。种丽伟[44]利用基因组、转录组水平鉴定，验证奶牛乳房炎抗性的相关基因，发现6 个新疆褐牛乳房炎抗性相关基因ZRANB3、PIAS1、ACTR3、LPCAT2、MGAT5、SLC37A2。

3 总结

总之，目前与奶牛天然免疫相关的基因较多，研究的也较为广泛，因此筛选对乳房炎抗性较强的基因，对奶牛进行定向培育、分子育种，在遗传上降低乳房炎发病率，对促进奶牛的高效健康育种具有重要意义。此外，天然免疫对改善奶牛繁殖及泌乳性能也具有重要影响，这是因为天然免疫不存在特异性，筛选天然免疫基因过程也可能对奶牛机体的乳腺及繁殖系统起良好调节作用。目前对奶牛相关天然免疫研究仍存在不足，可继续借助基因多态性、疾病性状的关联分析，进一步探寻可能影响奶牛天然免疫力的候选基因和标记分子，助力分子育种。