王士龙,朱景焕,孙晓波,宾彩艳

(广西科技师范学院,广西来宾 546199)

甘蔗(Saccharumofficinarum),甘蔗属,多年生高大实心草本,属C4作物,为喜温、喜光作物,广泛分布于热带及亚热带地区。土壤是甘蔗生产的基础,根系土壤中存在的物质与甘蔗产量和质量的形成密切相关。由于耕地面积有限,甘蔗种植单一连作现象比较普遍,连作障碍是常见问题,根际土壤中化感物质积累是引起连作障碍的主要原因之一[1]。张爱加等[2]研究表明,甘蔗幼苗期宿根根际土壤甲醇浸提液中与化感作用相关的物质主要有5大类54个,这些物质的积累抑制了宿根甘蔗的生长,同时也破坏了根际微生态,使得病原菌富集、土壤营养元素循环受阻,从而影响了甘蔗的产量和质量。李贤宇[3]研究也表明,宿根甘蔗根际土壤中积累的化感物质较多。

化感物质是植物分泌的次生代谢产物或植物凋落物的分解产物[4]。植物释放化感物质的途径大体上分为雨雾淋溶、自然挥发、残体分解和根系分泌4种,Rice等[5-11]将化感物质分为14种,有酚类、萜类、黄酮类、有机酸、脂族醛和酮等。化感物质具有选择性和专一性、复合效应和构效关系,其中的构效关系是指化感物质的性能很大程度上取决于化感物质的分子结构,进而决定其化感作用的性质和强度[12]。钱敏[13]利用化感物质的生物活性,合成了两大类共64个结构新颖的芳氧乙酰氧基异黄酮衍生物和芳氧乙酰氧基查尔酮衍生物,这两大类目标化感物质均表现出较高的除草活性。另外,化感物质也可开发成杀虫剂[14]。化感物质鉴定需要先对样品进行预处理,因此需要对甘蔗根系土壤中化感物质提取工艺进行优化。

有研究表明,植物地上部和土壤中的化感物质可以用溶剂提取法提取[15]。常用的有机浸提溶剂有甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等[15-21]。刘贤文等[1]研究马铃薯、玉米土壤中化感物质时采用甲醇溶剂辅助超声波处理,陈冬梅等[22]对连作烟草根际土壤化感物质提取和鉴定采用甲醇溶剂浸提,宋宇加[23]对人参根际土壤中化感物质的分离和鉴定采用甲醇提取。该试验采用甲醇试剂浸提并辅助超声波预处理方法,以质谱数据库检索出的化感物质种类数量为评价指标,并通过单因素和正交试验对预处理工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1仪器。电子天平(上海越平科学仪器公司,FA2004);鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械公司,GZX-GF101-3BS);箱式电阻炉(上海跃进医疗器械公司,SX2-5-12);数控超声波清洗器(昆山市超声仪器公司,KQ-300DB);台式高速离心机(湖南湘仪公司,H1850);漩涡混合器(上海医大仪器公司,XW-80A);旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂,RE-52AA);气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent,7890B/5977A GCMSD)。

1.1.2试剂。甲醇(色谱纯);MgSO4(分析纯),在使用MgSO4前用马弗炉以500 ℃烘6 h,180 ℃取出,置于干燥器内冷却备用。

1.2 GC-MS条件

1.2.1气相色谱条件。色谱柱为HP-5MS UI(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进口温度220 ℃,载气为氦(He),流量1 mL/min,进样量1 μL。气相色谱程序升温条件如表1所示,总运行时间41.33 min。

表1 气相色谱程序升温条件

1.2.2质谱条件。电离方式为EI;电子能量70 eV;阱温200 ℃,阱外套温度50 ℃,传输线温度280 ℃;扫描范围50～1 000 amu。应用计算机检索系统NIST MS将质谱数据与数据库进行匹配确定化感物质。

1.3 试验方法

1.3.1预处理方法。称取烘干的甘蔗根系土壤4.00 g(精确至0.01 g),置于50 mL具塞离心管中,加入甲醇(色谱纯)进行超声波处理,超声波处理后取上清液于圆底烧瓶中,用旋转蒸发仪进行蒸发浓缩,浓缩后用甲醇溶解并定容至10 mL具塞刻度试管中,将定容后的样液倒入50 mL具塞离心管中并加入0.5 g无水硫酸镁,混合2 min,再置于离心机进行离心,4 000 r/min条件下离心5 min,取上清液过0.22 μm有机针式滤膜后转移至进样瓶中,等待上机测定。

1.3.2单因素试验。

1.3.2.1料液比对检出化感物质种类数量的影响。分别加入16、20、24、28、32 mL甲醇溶剂进行超声波处理,即料液比为1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8(g∶mL),超声时间为60 min,超声功率为210 W,检测化感物质种类数量,找出最佳料液比。

1.3.2.2超声波功率对检出化感物质种类数量的影响。采用试验中确定的最佳料液比,在超声波处理时选择150、180、210、240、270 W不同超声波功率处理样品,检测化感物质种类数量,找出最佳超声波功率。

1.3.2.3超声波时间对检出化感物质种类数量的影响。采用试验中确定的最佳料液比和最佳超声波功率,在超声波处理时选择20、40、60、80、100 min不同超声波时间处理样品,检测化感物质种类数量,找出最佳超声波时间。

1.3.3正交试验。根据单因素试验结果,各取3个水平,以检测出的化感物质种类数量为指标,采用L9(34)正交表进行正交试验设计,正交试验因素水平如表2所示。

表2 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1料液比对检出化感物质种类数量的影响。如图1所示,经GC-MS测试,1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8不同料液比处理后样品所检测出的化感物质种类数量分别为12、14、13、12、11个。其中2,5-二叔丁基酚是5个处理中都检测出的化感物质,5个料液比中1∶5 处理时检测出的化感物质种类最多。当料液比低于1∶5 时检测出的化感物质逐渐减少,原因是甲醇量增大会使化学物质溶出增加,有些化学成分相互间发生反应生成其他物质,导致检测出的化感物质数量减少。因此,选择1∶5为最佳料液比。

图1 料液比对检测出的化感物质种类数量的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the quantity of allelochemicals detected

2.1.2超声波功率对检出化感物质种类数量的影响。如图2所示,经GC-MS测试,150、180、210、240、270 W不同超声波功率处理后样品所检测出的化感物质种类数量分别为11、13、15、12、11个。其中棕榈酸甲酯是经5个不同超声波功率处理后都检测出的化感物质。超声波功率为210 W处理时检测出的化感物质种类数量最多,当超声波功率高于210 W时检测出的化感物质逐渐减少,原因可能是超声波功率过高产生的空化效应过大,导致部分化学物质降解。因此,选择210 W为最佳超声波功率。

图2 超声波功率对检测出的化感物质种类数量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the quantity of allelochemicals detected

2.1.3超声波时间对检出化感物质种类数量的影响。如图3所示,经GC-MS测试,20、40、60、80、100 min不同超声波时间处理后样品所检测出的化感物质种类数量分别为11、13、14、16、16个。其中十一烷、2,5-二叔丁基酚、棕榈酸甲酯是5个不同超声波时间处理后都检测出的化感物质,超声波时间为80和100 min处理时检测出的化感物质种类数量最多。随着超声波时间的延长检测出的化感物质种类数量增加,可能是因为超声波时间延长会是使化学物质溶出更充分。因此,选择80 min为最佳超声波时间。

图3 超声波时间对检测出的化感物质种类数量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the quantity of allelochemicals detected

2.2 正交优化试验由表3可知,3个因素对甘蔗根系土壤中化感物质种类数量的影响由大到小依次为B>C>A,即超声波功率>超声波时间>料液比,各因素水平的最优组合为A2B2C3,该组合与正交试验5相同,即最优预处理条件是料液比1∶5、超声波功率210 W、超声波时间100 min。最优预处理条件检测出的化感物质如表4所示,共检测出化感物质种类为17个。

表3 正交试验结果

表4 最优预处理条件检测出的化感物质

1,3,5,6,7-pentamethylbicyclo[3.2.0]hepta-2,6-diene、2,5-二叔丁基酚、棕榈酸甲酯3种物质是9个正交试验设计中检测出的共有化感物质。棕榈酸甲酯可作为一种有开发潜力的植物杀螨剂[24],也可制备具有农药增效功能的助剂组合物;棕榈酸可以作为合成番茄红素的碳源,也可抑制病原真菌和线虫的繁殖,有效改善土壤环境[25]。

3 结论与讨论

为浸提出甘蔗根系土壤中的化感物质,采用甲醇浸提并辅助超声波预处理方法,通过单因素和正交试验对预处理工艺条件进行优化。结果表明,预处理的最优条件为料液比1∶5(g∶mL)、超声波功率210 W、超声波时间100 min,检测出来的化感物质有17个。从最优的预处理工艺检测出的化感物质种类数量还比较少,原因可能是在自然条件下,土壤中的非生物和生物等因素会发生迁移、化学转化和生物降解,可形成聚合物或降解成小分子物质,会对检测出的化感物质种类数量产生影响[26]。因此采集根际土壤样品应按照技术标准操作,并及时对样品进行预处理和上机检测。