马 朝，李 洁，余成龙，吴 德，林 燕

(四川农业大学动物营养研究所，四川 成都 611130)

1 前言

在禁抗大环境下，饲料抗生素的禁用使当前的生猪养殖业保持生猪健康面临着挑战，尤其是在仔猪断奶阶段出现的“仔猪断奶应激综合征” 更是影响着仔猪的生产性能和存活率[1]。 替抗药物的寻找，成为迫切需要。 前人研究发现，天然的植物中含有多种多糖和植物精油等植物化学物质[3]。 这些化学物质具有多种生物学功能，如刘毅等[4]研究的断奶仔猪在大肠埃希菌攻毒后，基础日粮中仅添加10 ppm的辣椒油树脂、大蒜植物和姜黄油树脂，就能有效缓解大肠杆菌感染引起的腹泻和炎症；还有邹毅等[5]研究的牛至精油，在育肥猪的日粮基础上连续补充25 mg/kg 牛至精油4 周，改善了肠道屏障的完整性，促进了炎症基因的表达。 当然还有其他人研究的植物提取物，都有抗生素的效果，使植物化学物质成为了替抗的可能[6-10]。

中医开出的药方集植物精华于一体，尤胜于前人的单个植物化学物质研究。 本试验结合前人研究，通过在断奶仔猪日粮中添加不同剂量的复方中草药饲料添加剂，研究提高断奶仔猪生产性能，防止仔猪腹泻等方面的积极作用。 为探究该复方中草药饲料添加剂推广使用以及替代抗生素和氧化锌的可行性[11]。

2 材料与方法

2.1 试验设计和试验饲粮

本次试验选取体况相近的DLY 断奶仔猪60 头(公母各半)，平均体重约8.7 kg，随机分为3 个处理组，即对照组 (基础日粮＋0.2%氧化锌＋0.5%酸化剂，T1)，中草药组1 (基础日粮＋1 kg/T 中草药，T2)，中草药组2 (基础日粮＋2 kg/T 中草药，T3)，每个处理组5 个重复，每个重复4 头猪。 饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)%

2.2 饲养管理及样品采集

动物饲养试验在四川农业大学动物营养研究所试验基地进行，整个试验期间猪只自由采食和饮水，所有猪只的饲养管理条件保持一致。 试验预饲期3 d，正式试验期28 d。 在试验结束当天，断料12 h 后，使用前腔静脉采集空腹血液5 mL，并分离血清。

2.2.1 生产性能测定 正式试验第1 天、第14 天和第28 天08: 00 对仔猪进行称重(空腹) 并记录，需计算平均日增重(ADG)。 每天早上喂料前记录每个圈的投料量和剩余量，统计后计算阶段平均日采食量(ADFI)，计算料肉比(F/G)。

2.2.2 腹泻评分与腹泻率 每天07:30 ～21:30 连续观测仔猪排粪情况，对每头猪每次排出的粪便进行腹泻评分，统计腹泻个体数并计算腹泻率。

腹泻评分标准: 条形或粒形粪便(0 分)；软粪、成形(1 分)；稠状、成形、粪水无分离现象(2 分)；液状、不成形、粪水有分离现象(3 分)。 得分为2 分和3 分者即为腹泻。 腹泻率计算公式如下: 腹泻率＝试验期间每日腹泻头数总和/试验猪总数*试验天数×100%。

2.2.3 免疫器官指数测定 试验结束后，在每个处理组中随机选择6 头仔猪进行屠宰，立即取出仔猪的胸腺、脾脏等免疫器官，剥离附着的脂肪后称重，记录，最后计算各免疫器官指数(公式如下)。 免疫器官指数 (%) ＝[免疫器官重量(g) /屠宰前活重(g)] ×100%。

2.2.4 肠道酶活性 分别取十二指肠、空肠和回肠黏膜样品，使用南京建成公司的相应测试试剂盒进行测定，测定上清液中糜蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的活性以及肠道蛋白总量。

2.2.5 肠道黏膜屏障、养分转运、免疫功能相关基因mRNA 相对表达量测定 总RNA 的提取: 严格按照RNA 提取试剂盒(Vazyme)操作，得到总RNA 后，在核酸蛋白仪上取RNA 样品测出相应的吸光度(OD 260 nm/OD 280 nm)应介于1.8 ～2.0。 用1% 琼脂糖凝胶电泳测定RNA 的质量和完整性。 反转录: 利用反转录得到cDNA，所有步骤严格按照反转录试剂盒(Vazyme) 说明书进行。 反转录所用pcr 仪(Bio-rad T100)。

引物设计: 用于实时PCR 分析的引物。如表2。

表2 肠道黏膜屏障、养分转运、免疫功能相关基因引物序列

2.2.6 肠道微生物收集仔猪盲肠和结肠食糜样品于冻存管中，存放于-80 ℃冰箱。 将食糜寄送(干冰运输) 到上海美吉生物医药科技有限公司进行相关的微生物组成测序工作。

2.3 数据统计

试验数据先通过EXCL 2019 版进行初步的处理，再使用SPSS 27.0 软件进行分析。 采用ANOVA 单因素方差分析和Duncan 多重比较分析。 数据用平均数± 标准误差表示，当P＜0.05 时表示差异显著，当P＜0.01 时表示差异极显著。

3 结果与分析

3.1 中草药添加剂对仔猪生产性能的影响

由表3 得知在1 ～14 天各处理组平均日增重以及平均日采食量差异不显著(P＞0.05)，但T2 组日增重高于对照组，且料肉比显著低于其他处理组(P＜0.05)。 而15 ～28 天以及试验全期来看，T2 组采食量极显著高于另外两个组(P＜0.01)，其他指标差异不显著。

表3 中草药添加剂对仔猪生产性能的影响

3.2 中草药添加剂对仔猪腹泻指数与腹泻率的影响

由表4 得知15 ～28 天T2 组腹泻率显著低于T1 组(P＜0.05)，且在整个试验全期，T2组的腹泻率和腹泻指数都略低于对照组以及T3 组。

表4 中草药添加剂对仔猪腹泻率和腹泻指数的影响

3.3 中草药添加剂对仔猪免疫器官指数的影响

由表5 得知T2 和T3 组脾脏重以及T2 组脾脏体脂数极显著高于对照组(P＜0.01)。处理组胸腺重以及胸腺体指数无显著差异。

表5 中草药添剂对仔猪免疫器官指数的影响

3.4 中草药添加剂对仔猪肠道发育以及组织学形态的影响

由表6 得知T3 处理组的十二指肠和回肠隐窝深度都极显著的增加(P＜0.01)。

表6 中草药添加剂对仔猪肠道组织形态的影响

3.5 中草药添加剂对仔猪肠道酶活性的影响

表7 反映了各个处理组肠道各种酶活性测定结果，T2 组十二指肠脂肪酶活性有增加的趋势(P＜0.1)，其他各指标没有显著差异(P＞0.05)。

表7 中草药添加剂对仔猪肠道酶活性的影响

3.6 中草药添加剂对仔猪不同肠段肠道相关基因表达的影响

从表8 可知，与对照组相比，T2 组可显著提高十二指肠ZO1 和SGLT1 基因表达水平(P＜0.05)，TNFα 有降低的趋势 (P＝0.062)；T3 组可显著提高CAT1、IL10、IL2基因表达水平(P＜0.05)。

表8 中草药添加剂对仔猪十二指肠基因表达的影响

从表9 可知，与对照组相比，T2 组可提高空肠SGLT1 基因的表达水平(P＝0.092)；T3 组可显著提高ZO -1、Claudin -1、IL10、IL2 基因表达水平(P＜0.05)，对TNFα 基因的表达有增加的趋势(P＝0.084)。

表9 中草药添加剂对仔猪空肠基因表达的影响

从表10 可知，与对照组相比，T2 组可显著提高回肠ZO1、CAT1、IL10 基因表达水平(P＜0.05)；T3 组可显著提高ZO -1、CAT -1、IL10、IL2 基因表达水平(P＜0.05)，对Claudin-1 有增加的趋势(P＝0.058)。

表10 中草药添加剂对仔猪回肠基因表达的影响

3.7 中草药添加剂对仔猪粪便微生物区系的测序和多样性的组成分析

通过对仔猪粪便样品16S rRNA 基因V3 ～V4 区序列进行了测定。 以物种水平97%的序列相似性为标准，共鉴定出871 个OTU，均属于Greengenes 分类的细菌域。 图1A、B 显示这3 个类群分别有的OTU，主要属于拟杆菌属、细菌属和变形杆菌属，在2 个肠段的3 个处理组中OTU 均没有明显差异，但是在日粮中添加2 000 g/T 的添加中草药制剂的OTU 数量最高。 由图1C、D 可知，T3 组在结肠段样品中显著增加了结肠粪便微生物多样性(P＜0.05)，而在盲肠阶段只有增加趋势，但是T2组的盲肠微生物粪便微生物确是减少状态。

图1 OTU 水平上的Venn 和微生物多样性指数

从CLASS 水平上(图2A、B) 可以看出梭状芽孢杆菌(Clostridia) 是优势菌，且梭状芽孢杆菌在结肠段T1 组和T2 组高于T3 组，而在盲肠段T2 和T3 组基本一致，反而高于T1 组，有趣的是拟杆菌(Bacteroidia) 也是在结肠随着复方中草药添加剂增加而增加，在盲肠减少。 由细菌OTUS 的主坐标分析(PCoA)显示，三组微生物群落的组成的粪便微生物有显著差异(图2C、D)。 而且在结肠段的样品中，T2 组样品聚类紧密，表明其细菌群落结构高度相似且稳定，而T1、T3 组样品聚类较疏松。 表明饲喂中草药添加剂可以改变仔猪肠道微生物区系。

图2 CLASS 水平粪便微生物群落柱形和主坐标分析(PCoA)

4 讨论

断奶仔猪腹泻是影响断奶仔猪生长性能的重要原因，其中植物提取物，如多糖和精油等，能有效的缓解影响断奶仔猪腹泻问题[2]。完整的中草药饲料添加剂配方可以在生产上发挥缓解应激，调节机体消化吸收的作用，如车向荣、李小成和陈淑珍等[12-14]的研究中表明草药饲料添加剂有缓解仔猪腹泻的作用。 本试验的仔猪腹泻率降低也证实这一观点。

断奶还会引起猪小肠绒毛高度的减少和隐窝深度的增加[15.16]。 根据对肠道组织形态测定结果分析可知，当日粮中添加2 000 g/T 的中草药制剂时会极为显著的增加隐窝深度。但从近年研究结果来看，有关于中草药饲料添加剂对于仔猪肠道组织形态的影响并不都是相同的结论。 陈清华等[17]研究表明与日粮中添加抗生素相比，添加0.1%牛膝多糖能显著提高肠道各段的绒毛高度以及降低隐窝深度，而刘惠等[18]研究发现添加0.06%的白术多糖对于各小肠段的隐窝深度和绒毛高度没有显著性影响。 本试验中采用的中草药饲料添加剂对于各肠段的绒毛高度没有显著性影响。 但当日粮中加入2 000 g/T的中草药饲料添加剂时会导致十二指肠和回肠隐窝加深，原因可能和中草药种类，成分以及添加量等因素有关。

肠道上皮的变化和肠道通透性增加是胃肠道功能障碍和病理的潜在因素[19，20]。 上皮屏障功能受损会增加细胞旁的通透性可能会使毒素、细菌进入全身组织，导致炎症或免疫反应[21]。 肠上皮屏障由各种不同的蛋白质组成，这些蛋白质也是检测肠道屏障的重要指标，如跨膜蛋白occludin、Claudin 和ZO - 1[22-24]。本试验结果表明，在日粮中添加中草药饲料添加剂，可以显著增加小肠段的ZO -1 和Claudin-1 基因的mRNA 相对表达水平，提示中草药添加剂能显著提高对肠道屏障功能。

植物提取物可降低猪的腹泻发生率，主要是因为提取物如多糖和植物精油等具有抗菌特性。 当然不仅仅是抗菌性，中草药添加剂还具有其他重要特性，如抗炎作用和免疫调节特性，可改善肠道免疫功能[25]。 在免疫功能方面，促炎细胞因子，如TNF - α、IL - 2 和IL-10，以及免疫器官作为淋巴细胞生成的场所，是检测免疫功能的重要指标。 陈雁南等[26]和陈强等[27]的研究结果显示，在仔猪日粮中添加复方中草药饲料添加剂能极显著的提高仔猪脾脏重和脾脏指数，这与本试验结果一致。 在日粮中添加中草药饲料添加剂，其中小肠段的IL-10，IL -2 和TNF -α 表达基因的显著提高，能快速反应小肠黏膜内的炎症，可以起到抗炎和免疫调节的作用。 本试验中，日粮中添加中草药饲料添加剂对免疫功能相关表达基因也有提升的趋势，与易延彬的研究结果基本一致[28]。

本研究发现日粮中添加中草药添加剂能显著改变盲肠和结肠的肠道菌群，更好的维持仔猪肠道健康。 在日粮中添加2 000 g/T 中草药添加剂后断奶仔猪小肠绒毛高度有增加的趋势，这不仅是饲喂中草药添加剂本身的成分的作用，可能还有肠道菌群的相关影响[8]。 同时研究发现，肠道菌群在维持黏膜内环境平衡中起着关键作用，影响肠道以外的免疫功能[30]。微生物组成的改变会导致免疫刺激增强、上皮功能障碍或黏膜通透性增强等现象[31，32]。 如致病性大肠埃希菌会释放毒素影响肠道黏膜，破坏微生物群和宿主肠道细胞之间的相互作用[33]。 结合上面的讨论，日粮中添加中草药饲料添加剂能有效平衡肠道菌群，达到缓解仔猪腹泻，增强TNFα、IL -2 和IL -10 的基因表达能力，增加血液中IL -2 的含量。 日粮中添加中草药饲料添加剂可以降低仔猪的腹泻发生率，提高抗炎作用和免疫调节的特性，改善肠道免疫功能。

5 结论

本研究证实，在日粮中添加1 000g/T 该复方中草药饲料添加剂能提高仔猪的生产性能，缓解仔猪断奶腹泻，增强仔猪免疫能力，同时稳定仔猪肠道微生物菌群。