吴春燕,蔡敏,廖如樱

(广西民族师范学院 化学与生物工程学院,广西 崇左 532200)

黑米是一种特殊的大米,包括香米、色米和专用米[1]。黑米的色素可当作一种天然安全可靠、绿色健康的活性物质,得到人们的青睐,具备广泛的研发价值与应用前景[2-3]。黑米表面皮存在有原花青素[4]。原花青素是一类多酚类化合物,化学结构也很复杂,还具有较强的抗氧化活性和自由基能力。研究表明,从天然产物中提取的原花青素具有抗衰老作用[5],改善尿路感染所致膀胱损伤、抑制炎症、调节免疫作用[6],减轻胰腺组织氧化应激、炎症损伤[7],以及抗疲劳[8]、抑制视网膜新生血管的产生[9]、抑制胶质瘤细胞[10]作用。

目前原花青素的提取的方法有:溶剂提取法[11]、低共熔溶剂提取法[12]、超声波提取法[13]、微波提取法[14]、酶提取法[15]及以上结合方法[16-18],本研究采用溶剂提取法提取黑米中的原花青素,为黑米的提取开发提供一定的理论依据。

1 实验材料和方法

1.1 材料

原花青素标准品(Tmstandard公司);黑米,购于崇左市国宝超市;香草醛,L(+)抗坏血酸,盐酸,乙酸乙酯,无水甲醇,30%过氧化氢,硫酸亚铁,七水,丙酮,无水乙醇,水杨酸,石油醚,成都市科隆化学品有限公司;DPPH,麦克林公司。

1.2 试验仪器

RE-52AA旋转蒸发器,上海闲德实验仪器有限公司;DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公司;SHZ-95B循环水式多用真空泵,河南省予华仪器有限公司;分析天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;FW100高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;A560紫外可见分光光度计,翱艺仪器(上海)有限公司;HK-2A超级恒温恒水水浴,南京南大万和科技有限公司;HXLG-10-50DG真空冷冻干燥机,上海泸析实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原花青素测定标准曲线

制备原花青素标准品溶液:准确称取20 mg原花青素标准品,用乙醇溶解后置50 mL容量瓶中,再加入乙醇溶液稀释定容到刻度,摇匀,配制成为0.4 mg/mL原花青素标准溶液,避光放置储存,作为储备液使用。

测定标准曲线[19]:准确移取0.4 mg/mL的原花青素标准品储备液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,再加乙醇溶液定容稀释到刻度,配制成质量浓度为0.04,0.08,0.12,0.16,0.20 mg/mL的原花青素乙醇溶液。

分别移取2.0 mL不同浓度的原花青素乙醇溶液于10 mL容量瓶中,再加入3.0 mL显色剂放到不同浓度的10 mL容量瓶中,以乙醇溶液定容至刻度,充分混匀后,避光静置60 min。将乙醇溶液代替样品溶液调零做空白对照试验,在500 nm处用紫外可见分光光度计测定吸光度。再根据样品溶液浓度与吸光度的关系,以原花青素标准品的浓度为横坐标(x),测得的吸光度值为纵坐标(y),绘制原花青素标准曲线,可得到回归方程。

1.3.2 花青素提取率的计算

(1)

式中:C为依据标准曲线计算出测定样液的浓度,mg/mL;V为提取液总体积,mL;V0为定容体积,mL;V1为取样量体积,mL;m为原料质量,g。

1.3.3 单因素试验

称取黑米粉末1.00 g,加入一定量的丙酮溶剂,在水浴下提取一定时间的提取物,离心,得到提取液。再加入3.0 mL显色剂,用乙醇定容稀释到刻度,充分摇匀后,静置60 min,再以紫外可见分光光度计500 nm处测定黑米原花青素的吸光度。固定料液比1∶30(g∶mL),丙酮体积分数为60%,水浴温度55 ℃,提取时间50 min。考查料液比、丙酮体积分数、水浴温度、提取时间对黑米原花青素提取率的影响。

1.3.4 正交试验

在单因素试验的基础上,设计四因素三水平L9(34)正交表,见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 乙酸乙酯萃取

采用乙酸乙酯萃取[20],称取黑米粉末置250 mL三角瓶中,按照正交验证最佳工艺条件下进行水浴提取三次,合并滤液得提取液。将提取液在旋转蒸发仪中减压浓缩至50 mL,加入100 mL石油醚置分液漏斗静置分层,下部成水层由下端放出,上层石油醚由上端倒出,萃取三次。水层、乙酸乙酯层按1∶2体积比萃取三次,于旋蒸仪中减压浓缩,经真空冷冻干燥设备中冷冻干燥24 h,得到黑米原花青素提取物,从而得出黑米原花青素提取纯度为60.15%。

1.3.6 抗氧化性的研究

1.3.6.1 原花青素提取液对DPPH·的清除能力测定[21]

DPPH配制:准确称取5 mg DPPH置于250 mL容量瓶中,再用无水乙醇溶解并定容稀释到刻度,摇匀即得质量浓度为0.02 mg/mL的DPPH溶液,避光保存。

原花青素样品及对照品抗坏血酸配制:先配制5 mg/mL母液样品,准确移取母液1,2,3,4,5,6 mL分别置于25 mL容量瓶中,再用乙醇溶液稀释定容到刻度,进行摇匀即可,使其样品质量浓度为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL。

分别准确移取不同浓度的黑米原花青素提取液2.0 mL置于10 mL比色管中,再加入2.0 mL DPPH溶液,进行摇匀,避光静置30 min,在517 nm处波长下进行测定其吸光度A1。同时准确移取不同浓度的黑米原花青素提取液2.0 mL,再加入2.0 mL无水乙醇,进行摇匀,避光静置30 min,在517 nm处波长下测定其吸光度A2。另准确移取2.0 mL纯化水和2.0 mL DPPH溶液反应作参比,进行混合均匀后,在避光静置30 min,在517 nm处测定其吸光度A0。平行测定3次,取平均值。空白组用无水乙醇代替,对照组用等浓度的抗坏血酸代替计算样品对DPPH的清除率。

(2)

式中:A0为纯化水与DPPH混合液的吸光度;A1为样品与DPPH混合液的吸光度;A2为样品溶液与无水乙醇混合液的吸光度。

1.3.6.2 原花青素提取液对·OH的清除能力测定[22]

H2O2与亚铁离子反应生成·OH,一般情况下·OH存活时间短反应活性高。当在反应体系中加入水杨酸,可以快速捕获·OH并生成紫色化合物(2,3-二羟基苯甲酸),在510 nm处有较大的吸收峰。

原花青素样品及对照品抗坏血酸配制:先配制5 mg/mL母液样品,准确移取母液1,2,3,4,5,6,7 mL分别置于25 mL容量瓶中,再用乙醇溶液稀释定容到刻度,进行摇匀,使其样品质量浓度为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mg/mL。分别准确移取1 mL不同样品浓度的黑米原花青素溶液置于10 mL比色管中,加入2 mL 6 mmoL/L FeSO4溶液、再加入2 mL 6 mmoL/L H2O2溶液,进行摇匀后,室温下静置10 min后,再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液,进行摇匀即得,静置30 min,空白组用纯化水代替,对照组用抗坏血酸代替,测定510 nm处下的吸光度A1。以纯化水代替上述原花青素的样品溶液,步骤同上,测定得吸光度A0。同时准确移取不同浓度的黑米原花青素提取液1 mL置于10 mL比色管中,加入2 mL 6 mmoL/L FeSO4溶液、再加入2 mL纯化水,进行摇匀,室温下静置10 min后,再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液,进行摇匀,静置30 min,在510 nm处测定吸光度A2。平行测定3次,取平均值,计算样品中原花青素·OH的清除率。

(3)

式中:A0为检测液不含原花青素的吸光度;A1为样品加过氧化氢溶液的吸光度;A2为样品不加过氧化氢溶液的吸光度。

2 实验结果与讨论

2.1 原花青素标准曲线的绘制

按1.3.1的方法,以横坐标为质量浓度(mg/mL),纵坐标为吸光度(A),进行原花青素标准曲线的绘制。可得线性回归方程为:y=0.479 8x-0.022 9(R2=0.999 1)。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对黑米原花青素提取率的结果分析

从图1可看出,在料液比1∶15 ～1∶30(g∶mL)时,料液比逐渐增大,原花青素的提取率上升,料液比为1∶30(g∶mL)时,原花青素的吸光度达到最大值。料液比继续增加,原花青素的提取率降低。因此,确定最佳料液比为1∶30(g∶mL)。

图1 料液比对黑米原花青素提取率的影响

2.2.2 丙酮体积分数对黑米原花青素提取率的结果分析

在图2中,随着提取丙酮体积分数的增加,原花青素提取率的趋势先增加后下降,丙酮体积分数为60%时,原花青素提取率最高。当丙酮体积分数继续增大时,相应的水离子减少,即溶出的原花青素提取率会减少。因此,最佳丙酮体积分数选择为60%。

图2 丙酮体积分数对黑米原花青素提取率的影响

2.2.3 时间对黑米原花青素提取率的结果分析

由图3可知,提取时间从30 min到50 min时,原花青素提取率上升,当提取时间超过50 min之后,原花青素提取率降低,可能是由于时间过长会使原花青素分解,造成提取率降低。因此,确定50 min作为最佳提取时间。

图3 提取时间对黑米原花青素提取率的影响

2.2.4 温度对黑米原花青素提取率的结果分析

由图4可知,原花青素提取率也随温度升高而升高,当温度达高于55 ℃时,继续升高温度提取,提取率下降。因此,选择提取最佳温度55 ℃。

图4 温度对黑米原花青素提取率的影响

2.3 正交优化实验结果

在单因素试验的基础上,采用正交试验设计方法,研究料液比(A)、丙酮体积分数(B)、水浴温度(C)、提取时间(D)四个因素对黑米原花青素提取率的影响,结果如表2所示。

表2 黑米原花青素提取的正交试验结果

由表2可知,各个因素的极差顺序为RA>RD>RC>RB,故料液比对原花青素提取率影响最大。最佳组合为A3B2C2D3,最佳提取工艺为料液比1∶35(g∶mL),丙酮体积分数60%,提取温度55 ℃、提取时间60 min。对最佳提取工艺做验证试验,重复3次,得出黑米中原花青素的平均提取率为0.531 2%。

2.4 抗氧化活性试验结果

2.4.1 黑米原花青素对DPPH·的清除作用

由图5可以看出,在选定浓度范围内,黑米原花青素对DPPH·具有清除能力,随着浓度的增加,DPPH·的清除能力也逐渐增强,在相同条件浓度下,抗坏血酸略高于黑米原花青素对DPPH·的清除能力。

图5 黑米原花青素对DPPH·的清除作用

2.4.2 黑米原花青素对·OH的清除作用

由图6可知,在选定浓度范围内,随着浓度的升高黑米原花青素与抗坏血酸对·OH清除的清除率均呈上升趋势,可见,在相同条件浓度下,抗坏血酸略高于黑米原花青素对·OH的清除能力。

图6 黑米原花青素对·OH的清除作用

3 结论

黑米中含有的花青素对人体有益,黑米具有较大的开发价值及应用前景。本文采用溶剂提取法提取黑米中原花青素,通过单因素试验和正交试验考察了丙酮体积分数、提取时间、温度、料液比对黑米原花青素提取率的影响,得出黑米中原花青素的最佳工艺条件为丙酮体积分数60%、提取时间60 min、料液比1∶35(g∶mL)、提取温度55 ℃,黑米原花青素提取率是0.531 2%,纯度为60.15%。采用DPPH清除能力和·OH清除能力衡量黑米中原花青素的抗氧化性,试验表明,黑米中的原花青素可以有效清除DPPH和·OH,提取的原花青素有较好的抗氧化性。本研究为黑米的提取开发提供一定的理论依据。