王绵绵 王振华 余二梅

（1 福建医科大学附属第二医院心内科，福建 泉州 362000；2 福建医科大学附属第二医院超声科，福建 泉州 362000）

近年来，越来越多的证据显示，作用于生命早期（组织可塑性生长发育特异时间窗）的环境因素，明显影响成年期慢性疾病发生的危险。医学界首先提出成年期疾病的“早”或“胎儿”起源假说。该假说认为，环境因素（特别是营养）作用于生命早期，可程序性控制成年期心血管与代谢性疾病的发生和早产儿死亡的风险。最近的研究表明，孕妇吸烟、产前尼古丁暴露可导致子代长期持续性新陈代谢系统与心血管系统异常。尼古丁作为胆碱能受体激动剂可以在心血管和内分泌体内平衡中扮演重要的角色。妊娠期间尼古丁暴露会导致许多胎儿问题，包括宫内生长迟缓和早产[1]。烟草中的尼古丁可透过胎盘，并优先集中在胎儿，导致其在胎儿循环和羊水中的含量比孕妇更高[2]。循环内皮祖细胞（circulating endothelial progenitor cell，EPC）在EC细胞再生中起重要作用。EPCs全身输注或内在动员可增强局部内皮剥脱后的修复，从而使血管再内皮化。本研究旨在明确PNE对子代大鼠血管EPCs的影响，探讨这些效应是否存在潜在的性别依赖性差异，并进一步明确这些效应是否可持续作用至日后成年期。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（清洁级，6周龄，体质量150～200 g）20只，健康雄性SD大鼠（清洁级，6周龄，体质量200～250 g）10只，总共30只（由上海斯莱克动物实验中心提供），许可证号SCXK（沪）2012-0002。

1.2 实验试剂 尼古丁购自美国Sigma公司，PBS缓冲液购自赛默飞世而生物化学制品有限公司，Rabbit Anti-CD133/PE antibody、Rabbit Anti-CD34/FITC antibody、Rabbit IgG（H+L）/PE conjugated、Rabbit IgG/FITC conjugated均购自英国Abcam公司。

1.3 模型的建立 将SD大鼠饲养于自然光照，空调控制温度（20±2）℃，由吊扇及排气扇通风的饲养室中，自由摄取大鼠标准饲料（购自福州吴氏实验动物有限公司）和清洁自来水。参考先前的报道建立大鼠产前尼古丁暴露（perinatal nicotine exposure，PNE）模型。将28周龄SD大鼠，按1∶1雌雄随机合笼，用托盘法监测阴栓，平均每12 h检查1次，以发现阴栓记为妊娠第1天。将孕SD大鼠随机分成两组，PNE组10只，正常组10只。孕SD大鼠经氯胺酮和赛拉嗪麻醉，于背部作一切口，将渗透微泵（2ML4型）植入切口后缝合。其中PNE组植入的1/2渗透微泵携带102 mg/mL尼古丁，另一半则为生理盐水作为正常组，每日按6 mg/（kg·d）剂量率给予。每只孕鼠1个笼子。所有孕鼠自然分娩，仔鼠与母鼠笼养4周后，根据观察肛门跟生殖器的距离以及乳头突的有无，将雌雄子代分笼喂养。分别于子代1、3、4、6、12月龄时进行实验，测量数据。

1.4 流式细胞术检测EPCs数量

1.4.1 实验动物的取血 分别于子代大鼠1、3、6、12月龄时给每只大鼠称重，按0.3 mL/100 mg的剂量给予10%水合氯醛麻醉，将大鼠尾部拉起，待大鼠安静时，快速从腹腔注射，必要时追加麻醉。待大鼠麻醉满意后，将大鼠平放于手术器皿上，头朝下，用备皮刀刮去大鼠右侧颈部毛发，将1 mL注射管用生理盐水稀释的肝素钠润洗，触摸到大鼠颈部血管搏动，在搏动最明显的三角处快速进针，回抽形成负压，缓慢退针，见回血后，保持位置，抽血至1 mL，拔掉针头（因1 mL注射器针头太细，直接打出来可能会破坏细胞），打开血常规管的橡皮塞，将血液注入后快速盖上橡皮塞，再往血常规管内打入空气，防止橡皮塞脱出；若未成功抽出血，于进针处剪开皮肤，探查颈静脉，抽血。将血常规管放入装有冰袋的泡沫盒内，送至医院中心实验室4 ℃冰箱内，待检。

1.4.2 测定EPCs数量 ①取样：将血液样本从4 ℃冰箱中取出，将血常规管放入离心机1 000 r/min，离心30 s，将管壁上的血液离到管底，再在震荡机上震荡10 s，取流式细胞管标记空白、IgG、CD34、CD133、1～n PF。分别从1～n号管中取400 μL血样于1～n号流式管中。②溶血：按1∶5比例加入红细胞裂解液，分别于1～n号管中加入2 000 μL红细胞裂解液，震荡机上震荡后避光反应20 min，观察溶血情况（以血液清澈透亮为优），再放入CH80-2S台式低速离心机中离心2 000 r/min，5 min，去上清液，再分别加入1 000 μL红细胞裂解液，再震荡机上震荡后避光反应10 min。③离心：将流式管配平后放入离心机离心（2 000 r/min，5 min），去上清（一次倾倒，至少保证100 μL剩余）。洗涤：分别于1～n号管中加入2 000 μL中性PBS液，震荡（将沉在管底的细胞震匀）后放入离心机离心5 min，去上清；再分别加入2 000 μL中性PBS液，离心5 min，去上清；震荡后再分别加入1 000 μL中性PBS液，离心5 min，去上清（反复洗2～3次）。④染色：为了保证细胞浓度，去上清液后不再加入PBS液，而是将去完上清的剩余样本放入震荡机上震匀。将4个抗体旋紧后放在小离心机上离心3 s，在IgG管中加入3 μL IgG-PE和3 μL IgG-FITC，在CD34管中加入3 μL CD34-FITC，在CD133管中加入3 μL CD133-PE，分别在1～n PF管中加入3 μL CD133-PE和3 μL CD34-FITC。分别从1～n号管中取100 μL血样于1～n PE号流式管中。分别再1、2、3、4号管中加入100 μL中性PBS液，再从中抽取100 μL样品于空白管，IgG管，CD34管，CD133管。震荡10 s，避光孵育30 min。上机：取出后加入200 μL生理盐水，摇匀，放入离心机离心（2 000 r/min，5 min），去上清，再加入200 μL生理盐水，摇匀，上机检测。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 19.0统计软件包对数据进行分析，计量资料采用（）表示。正态分布资料两组间均值比较，采用t检验，非正态分布资料两组间均值的比较采用Mann-WhitneyU非参数检验。采用一般线性模型的Univariate过程，进行完全随机分组析因设计的多因素方差分析，分析各因素的主效应及交互作用。血管环内皮功能的检测则采用GraphPad Prism 5软件中的Two-way ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 经流式细胞术检测1月龄子代大鼠外周血EPCs数量 雌性子代外周血EPCs，PNE组较正常组显著降低（P＜0.05），雄性子代，PNE组与正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图1A；PNE组，雌性子代较雄性子代显著降低（P＜0.05），正常组，雌性子代与雄性子代差异无统计学意义（P＞0.05），见图1B。

图1 经流式细胞术检测1月龄子代大鼠外周血EPCs数量

2.2 经流式细胞术检测3月龄子代大鼠外周血EPCs数量 雌性子代，PNE组与正常组差异无统计学意义（P＞0.05），雄性子代，PNE组与正常组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2A；PNE组，雌性子代与雄性子代差异无统计学意义（P＞0.05），正常组，雌性子代与雄性子代差异无统计学意义（P＜0.05），见图2B。

图2 经流式细胞术检测3月龄子代大鼠外周血EPCs数量

2.3 经流式细胞术检测6月龄子代大鼠外周血EPCs数量 雌性子代，PNE组较正常组显著升高（P＜0.05），雄性子代，PNE组较正常组显著升高（P＜0.05），见图3A；PNE组，雌性子代较雄性子代显著升高（P＞0.05），正常组，雌性子代与雄性子代差异无统计学意义（P＜0.05），见图3B。

图3 经流式细胞术检测6月龄子代大鼠外周血EPCs数量

2.4 经流式细胞术检测12月龄子代大鼠外周血EPCs数量 雌性子代，PNE组与正常组差异无统计学意义（P＞0.05），雄性子代，PNE组与正常组差异无统计学意义（P＞0.05），见图4A；PNE组，雌性子代与雄性子代差异无统计学意义（P＞0.05），正常组，雌性子代与雄性子代差异无统计学意义（P＜0.05），见图4B。

图4 经流式细胞术检测12月龄子代大鼠外周血EPCs数量

2.5 PNE、性别、年龄对EPCs数量变化的影响 PNE、性别、年龄对EPCs数量的变化有影响，且三者之间存在交互作用。见表1～3。

表1 性别对EPCs水平的影响

表2 PNE对EPCs水平的影响

3 讨论

PNE可诱导子代内皮功能病理生理改变，而内皮功能障碍主要表现在NO的生物利用度减少和EC的进行性丢失。对于EC的丢失，在生理条件下，可通过增加EC的更新对损伤进行修复。另一方面，EPCs对EC的再生以及内皮的损伤修复起重要作用。EPC水平已被提议作为血管内皮功能障碍的重要的生物标志物。然而，EPCs水平与血管内皮功能障碍之间的关系仍存在争议[11]。EPCs是体内的一种干细胞，其能分化为内皮细胞，后者是新生血管的重要组成部分。本研究采用流式细胞仪对CD34、CD133双染荧光标记分离EPCs并对其进行定量检测，结果表明，PNE影响雌性子代EPCs的数量变化，而雄性子代无明显变化，提示PNE可诱导EPCs水平的改变，该效应存在性别差异，且持续作用至成年期。有动脉粥样硬化性血管疾病的风险因素的患者其外周EPCs的数量显著减少[3-4]。PNE可导致子代长期持续性新陈代谢系统与心血管系统异常，诱导子代内皮功能病理生理改变，且大量研究证实，EPCs对EC的再生以及内皮的损伤修复起重要作用。EPC水平已被提议作为血管内皮功能障碍的重要生物标志物。EPCs可通过增殖分化为成熟内皮细胞的方式，使受损的血管再内皮化，故EPCs具有防止动脉粥样硬化的作用[5-6]。由于EPCs具有强大的增殖能力，其数量能在一定程度上反映内皮细胞的功能及其对血管修复的程度，从而在一定程度上利于血管存在危险因素风险的分析以及对血管功能的评价。

到目前为止，国内外罕见对PNE与EPCs的关系的研究资料，本研究发现EPCs的数量变化受很多因素的影响，通过单因素的方差分析可知，PNE、性别以及年龄均对其变化均有影响，且两两之间、三者之间均存在交互关系，提示PNE、性别以及年龄共同作用EPCs的数量变化。本研究对PNE的1、3、6、12月龄的子代大鼠进行观察，发现在其他条件相同的情况下，年龄对EPCs数量的变化起作用。除了年龄的影响，还发现性别对EPCs数量也存在影响。近期的研究表明，EPCs在雌激素的作用下能对损伤血管进行修复[7-8]。另一项研究发现，雌二醇不仅对内皮细胞有调控作用，还可诱导外周血循环EPCs的数量增加，从而抑制受损血管的内膜增厚[9]。通过以上研究可推测雌激素作用的血管修复可能是通过EPCs介导的。最近的研究发现，高血压模型大鼠与正常对照组相比，骨髓EPCs的功能有所下降，另一方面用雌激素干预的实验组与正常对照组相比，其EPCs的功能明显增强[10-11]。用雌激素干预体外培养EPCs，分不同时间段，分不同溶度加入雌激素，发现在一定范围内EPCs的数量和功能呈时间依赖性差异以及溶度依赖性差异特征[12-13]。目前，雌激素对EPCs的生物学功能、动员及改善的具体机制尚不清楚。而雌激素与EPCs的数量改变有关，但二者不符合线性关系[14-15]。

与雄性子代血管内皮功能损伤相比，雌性子代的内皮功能未损伤反而升高，考虑其原因可能是雌激素的保护作用。但雌激素是通过什么机制对血管内皮功能进行保护的尚不清楚。本研究发现，在PNE的作用下，雌性子代的EPCs数量有升高，而雄性子代的EPCs的数量未见变化，结合之前的研究报道雌激素对EPCs有激动作用，认为雌激素可能通过刺激EPCs的动员、增殖、促进血管修复，从而使雌性子代的内皮功能代偿性升高，而雄性子代可能因为缺乏雌激素对EPCs的激动，EPCs数量没有发生变化，从而使血管内皮功能发生损伤。到目前为止，国内外对PNE与EPCs的关系的研究资料非常少，虽然研究发现PNE、性别、年龄对EPCs数量的变化有影响，且这三者之间存在交互作用，但对其相互作用的机制尚不明确，需在以后的研究工作中一步深入探讨。由于孕妇烟草暴露是最广泛的产前损伤刺激之一[16-17]。因此，明确孕妇吸烟对动脉粥样硬化发病的影响，有助于进一步揭示这种发生在子宫内的程序性控制，导致子代出生后动脉粥样硬化疾病的病理现象，并有助于深入理解该现象潜在的病理生理机制，从而对优生优育及心血管疾病的防治具有重要的实际意义和理论价值。