郑 锴, 罗秀玲, 张玮豪, 刘宇利, 李玉明, 廖尚高

贵州医科大学附属医院 1.神经外科;2.头颈肿瘤科,贵州 贵阳 550004;3.贵州医科大学 药学院,贵州 贵阳 550004

垂体腺瘤(pituitary adenoma,PA)是起源于垂体前叶的良性肿瘤,是继神经胶质瘤和脑膜瘤之后的第3大常见原发性脑肿瘤,约占所有颅内肿瘤的15%[1]。临床上无功能的PA主要表现为对周围结构的占位效应,包括视交叉和垂体,分泌性PA会刺激某些下丘脑-垂体-器官轴并表现为肢端肥大症和库欣病等[2]。PA的临床体征、神经病理学特征、增殖活性和可能侵入周围解剖结构的生长模式等影响因素存在巨大异质性,对其病程的预测非常具有挑战性[3]。治疗PA的最终目标是延长患者生存期和改善患者生活质量,虽然绝大多数PA是良性的,可以通过手术、放疗及药物进行治疗,但有些PA对上述治疗无反应[2,4]。因此,寻找与PA密切相关、可对其预后进行预测的生物标志物十分必要。跨膜4超家族(trans-membrane 4 superfamily,TM4SF)蛋白可促进细胞与细胞外基质的相互作用,增强肿瘤细胞间的凝聚力,减少吞噬和侵袭,抑制肿瘤细胞转移,KAI1/CD82是TM4SF的成员,可抑制大多数肿瘤的转移,与肿瘤侵袭和预后显著相关[5]。有研究发现,KAI1/CD82在某些恶性肿瘤中表达降低,与恶性进展、转移及预后密切相关,如甲状腺状微癌、鼻咽癌等[6-7]。本研究旨在探讨KAI1/CD82在PA中的表达及其对预后的影响,为临床中PA的防治提供新的研究方向。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取贵州医科大学附属医院自2020年5月至2021年10月收治的72例PA患者为研究对象。纳入标准:临床初次确诊为PA[8];无家族性疾病病史;既往无手术史;术前无放疗、化疗史。排除标准:合并严重多器官疾病;合并身体其他部位肿瘤;合并已明确的长期内分泌疾病;术后病理石蜡切片初筛发现瘤组织稀少,大片坏死及血凝块等杂质过多。根据Knosp分级[9]进一步将研究对象分为侵袭性PA 37例(Knosp 3级20例,Knosp 4级17例),非侵袭性PA 35例。72例患者中,男性34例,女性38例;年龄18～72岁,平均年龄41.53岁;至入院时病程20 d至8年,平均病程16.24个月;按激素类型分类,无功能腺瘤15例,催乳素腺瘤33例,生长激素腺瘤14例,促甲状腺激素腺瘤5例,促性腺激素细胞腺瘤型5例;经蝶手术40例,经颅手术32例。患者及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组织化学法 收集患者手术瘤组织(1.0～1.5 cm)及少量瘤旁正常组织。将石蜡包埋的PA组织进行4 μm切片,石蜡切片脱蜡和再水合,在乙二胺四乙酸(pH 9.0)中煮沸20 min进行抗原修复,避光条件3%过氧化物酶封闭10 min。将切片与10%山羊血清孵育30 min以阻断非特异性染色,然后与一抗KAI1/CD82抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)在室温下孵育60 min。此后在室温下与二抗一起孵育30 min,使用3,3′-二氨基联苯胺显色并用苏木精复染。空白对照使用相同体积的PBS缓冲液取代KAI1/CD821抗体。封片后置于显微镜下进行观察。

1.3 结果判定 KAI1/CD82蛋白表达水平通过半定量IHC评分系统确定,该系统基于阳性细胞百分比和细胞染色强度的总组合进行评分。阳性细胞的百分比评分:0分,无阳性细胞;1分,不超过5%阳性细胞;2分,超过5%且25%以下细胞染色阳性;3分,不少于25%且不超过50%细胞染色阳性,4分,50%以上细胞染色阳性。染色强度评分:1分,淡黄色;2分,黄棕色;3分,棕褐色。计算每个组织样本的总分,总分>3分为阳性,总分≤3分为阴性。

1.4 荧光定量聚合酶链反应法 使用Trizol总RNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司)提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度,使光密度260/光密度280为1.8～2.0,使用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)转录合成cDNA。使用qRT-PCR试剂盒(德国Qiagen公司)配置25 μl反应体系:SYBR Green I qPCR Master Mix 12.5 μl,正反向引物各0.5 μl,cDNA模板2.5 μl,ddH2O 9.0 μl。混匀后在荧光定量聚合酶链反应仪(美国ABI公司)中进行扩增,反应设置为95℃预变性2 min,95℃变性15 s,60℃退火20 s,72℃延伸20 s,共40个循环。根据NCBI相应的序列设计引物,引物序列见表1。反应结束后以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算KAI1/CD82的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 随访及预后 在术后次日开始随访,方式包括电话、短信及门诊复查,周期为6个月。根据患者的预后情况,进一步将研究对象分为预后良好组(缓解)和预后不良组(未缓解)。患者预后未缓解标准:随访期内术后观察到新肿块或磁共振成像诊断剩余肿块体积增加。

2 结果

2.1 KAI1/CD82在PA组织、瘤旁组织中的表达水平 PA组织KAI1/CD82阳性率[51.39%(37/72)]低于瘤旁组织[75.00%(54/72)],KAI1/CD82 mRNA表达低于瘤旁组织[(0.65±0.18)比(1.01±0.32)],差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 KAI1/CD82在侵袭性、非侵袭性PA组织中的表达水平 侵袭性PA组织KAI1/CD82阳性率[35.14%(13/72)]低于非侵袭性PA组织[65.71%(23/72)],KAI1/CD82 mRNA表达低于非侵袭性PA组织[(0.46±0.13)比(0.85±0.27)],差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 影响PA患者预后的单因素分析 PA患者的预后情况与瘤卒中、侵犯海绵窦、侵袭性肿瘤、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子、C反应蛋白、KAI1/CD82有关(P<0.05)。见表2。

表2 影响PA患者预后的单因素分析/例(百分率/%)

2.4 Logistic多因素分析 瘤卒中是影响PA患者不良预后的独立危险因素(P<0.05);高水平KAI1/CD82是影响PA患者不良预后的独立保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 Logistic多因素分析

2.5 KAI1/CD82对PA患者不良预后的预测价值 KAI1/CD826水平预测PA患者不良预后的ROC曲线下面积为0.847(95%可信区间0.743～0.921),灵敏度为96.67%,特异度为66.67%,临界值为0.630。见图1。

图1 瘤组织中KAI1/CD82水平预测PA患者不良预后的ROC曲线

3 讨论

PA是常见的颅内肿瘤,在总人群中的患病率为0.1%[10-11]。因高度增殖和侵袭性,侵袭性PA具有浸润周围关键结构的倾向,如海绵窦、蝶骨、颅神经等,也可能扩散到海绵窦或颈内动脉周围区域,很难完全切除[12-13]。手术治疗对非功能性PA有益,却无法完全切除某些肿瘤,因此,治疗PA的目的是减轻或消除肿瘤占位病变的影响,纠正肿瘤过度释放激素,使垂体维持正常功能[14]。垂体瘤切除手术复发率为7%～35%,且可能导致尿崩症、蝶骨窦炎、脑脊液渗漏、视力障碍恶化、脑瘫、脑膜炎等问题[15]。

KAI1/CD82是一种跨膜蛋白,是在各种组织类型中表达的进化保守分子,其首先被确定参与T细胞活化过程,现报道为肿瘤转移抑制基因[16]。Al-Khater等[17]认为,KAI1通过调节细胞运动和侵袭、诱导细胞衰老、细胞间粘附和细胞凋亡等机制来抑制实体癌的转移。有研究发现,CD82可通过阻断TGF-β1/Smad信号通路,在肾细胞癌的迁移和侵袭中表现出抑制作用[18]。本研究中:PA组织KAI1/CD82阳性率低于瘤旁组织,KAI1/CD82 mRNA表达低于瘤旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);侵袭性PA组织KAI1/CD82阳性率低于非侵袭性PA组织,KAI1/CD82 mRNA表达低于非侵袭性PA组织,差异有统计学意义(P<0.05)。这提示,KAI1/CD82参与且抑制PA的发生和发展。Du等[19]发现,KAI1表达与黑色素瘤、结直肠癌患者的预后显著相关,当KAI1表达水平较低时,患者生存时间缩短。本研究结果显示:高水平KAI1/CD82是影响PA患者不良预后的独立保护因素(P<0.05);KAI1/CD826水平预测PA患者不良预后的ROC曲线下面积为0.847(95%可信区间0.743～0.921),灵敏度为96.67%,特异度为66.67%,临界值为0.630。这提示,KAI1/CD826与PA患者的预后显著相关,对PA患者不良预后的预测价值较好。

垂体瘤卒中是一种不常见的综合征,会导致垂体肿瘤或腺体自发性出血或梗死,其最常见于所有类型的垂体偶发瘤中的非功能性PA,可引发头痛、意识改变,甚至昏迷、死亡[20]。本研究中,瘤卒中是影响PA患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。因此,为提高患者生存率,需对其进行预防。白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子、C反应蛋白是细胞因子级联和癌症进展的主要炎症调节因子[21]。炎症因子受NF-κB信号通路调控,而NF-κB在PA中起着重要作用[22-23]。本研究发现,PA患者的预后情况与白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子、C反应蛋白有关(P<0.05)。这提示,不良预后的PA患者机体处于高炎状态。因此,笔者推测,低水平KAI1/CD82会加重PA,使患者体内炎症积累,激活NF-κB信号通路,导致预后不良。

综上所述,KAI1/CD82在PA组织中水平降低,其有望成为PA患者不良预后发生的预测因子。