乐金海 林湘东 向 茗 张 强 胡 哲

(1 湖南中医药大学第一附属医院,长沙,410007; 2 湖南中医药大学中医诊断研究所,长沙,410208)

缺血性脑血管疾病是致残、死亡的重要危险因素[1-2]。缺血性脑血管疾病往往发病突然,若未得到及时救治极易造成脑组织的不可逆损害,存在诸如半侧肢体功能障碍、语言障碍等后遗症,是严重威胁居民健康与生命、降低患者生命质量、增加患者不良事件风险的常见病、多发病[3]。现阶段缺血性脑血管疾病是医学界颇为棘手的难题,是研究者亟须攻克的临床重点,当前临床治疗本病的关键是重建脑组织血运,恢复缺血区域血液供应,改善脑组织损伤程度[4]。但是CAMPBELL等[5]研究显示,脑卒中患者的脑组织在重建血运之后,缺血再灌注的脑组织会发生异常凋亡事件,触发局部脑组织一系列级联效应,反而加剧缺血区域的损伤程度,形成缺血再灌注损伤。寻求治疗缺血性脑血管疾病,保护脑组织缺血区域再灌注损伤的治疗方法意义重大。

缺血性脑血管疾病属于中医学“中风”“卒中”等范畴[6],诸多医家对本病的病因病机及发展预后多有论述,认为“气虚血瘀,脑络受阻”是本病的基本病机,“益气活血,护脑安神”是治疗本病的基本原则[7-8]。脑泰通组方是湖南中医药大学第一附属医院治疗缺血性脑血管疾病的效方,在多年的临床运用中取得了显著、稳定的疗效,不良反应较小,但其具体作用机制仍需要进一步明确。尼莫地平是目前临床用于改善急性脑血管病血液循环的西药,目前该药联合中医药治疗脑卒中、改善脑缺血病变的研究较多,但其联合中药复方改善脑组织缺血再灌注的研究鲜有报道。本研究以前期预实验为基础,采用大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型构建局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,基于转录因子叉头框蛋白O3a(Forkhead Box O3a,FoxO3a)/低氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)/核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)信号通路探讨脑泰通组方对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的影响及保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 100只无特定病原体动物(Specific Pathogen Free,SPF)级健康雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,6～7周龄,180～200 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号:SCXK(湘)2019-0004,合格证号:43072663411303347,实验前给予1周适应饲养,环境温度22～26 ℃,湿度55%～60%,自由摄食,实验全程按照动物伦理学标准进行(伦理审批号:LL201818B240)。

1.1.2 药物 脑泰通组方中药材购于湖南中医药大学第一附属医院中药房,经制剂鉴定中心鉴定合格,具体药物组成:黄芪20 g、当归10 g、赤芍10 g、川芎10 g、桃仁10 g、红花10 g、三七10 g、人参10 g、地龙10 g。上述中药材经纯净水浸泡1 h后由制剂室根据人等效剂量进行水煎浓缩为浸膏剂,使其终浓度为1.80 g/mL,置于常温下阴凉处储存;尼莫地平(拜耳医药保健有限公司,德国,批号:20210307)。

1.1.3 试剂与仪器 FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、B细胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)抗体(Proteintech公司,美国,货号:66428-1-Ig、20960-1-AP、10745-1-AP、28205-1-AP、12789-1-AP、50599-2-Ig);HRP goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech公司,美国,货号:SA00001-1);磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution,PBS)(Hyclone公司,美国,货号:80334412);电镜(徕卡公司,德国,型号:8344-Ⅱ);荧光PCR板(Thermo,美国,型号:66347-A);电动摇床(江苏其林贝尔仪器制造公司,型号:TS-92);水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂,型号:JK3056);荧光定量PCR仪(Thermo,美国,型号:PIKOREAL96);电泳仪(北京六一仪器厂,型号:DYY-2C);转膜仪(北京六一仪器厂,型号:DYCZ-40D),其余实验试剂及仪器均由实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参考MIAO等[9]的局灶性脑缺血再灌注大鼠模型构建方法(MCAO法),具体为:随机选取90只SPF级SD大鼠,术前禁食12 h,制备尼龙绳栓结,配制10%水合氯醛(300 mg/kg)。麻醉大鼠后取仰卧位颈中部术口,分离各层组织及右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉,于颈总动脉分叉近心端结扎颈外动脉并以小动物动脉夹阻断血流,于颈外动脉分叉行V形切口,将制备好的无菌尼龙绳栓结缓慢放入并收紧线结,放开小动物动脉夹,缓慢将尼龙绳栓结沿着冠状动脉经过颈内动脉放入大鼠脑内,放入约20 mm,感觉到存在阻力时立即停止放入线结,使线结尾端平齐冠状动脉起始处,阻断冠状动脉血流,拉紧尼龙绳,行止血操作,缝合术口,单笼饲养。待大鼠苏醒后,根据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评分法对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型进行评价,即NIHSS评分2～3分的大鼠视为成模,纳入后续研究。在本研究,共死亡24只,成功造模53只。随机选取40只已成模的局灶性脑缺血再灌注大鼠,分为模型对照组、阳性药物组(尼莫地平组)、中药组(脑泰通组方组)、联合用药组(尼莫地平+脑泰通组方组),每组10只。另选取10只健康的SPF级SD大鼠作为假手术组,仅给予同部位分离颈内、外动脉及颈总动脉,不用尼龙绳栓结。

1.2.2 给药方法 假手术组与模型对照组均予以2 mL的0.9%生理盐水灌胃;中药组大鼠给予脑泰通组方浸膏灌胃,给药剂量0.9 g/kg,1次/d;阳性药物组给予尼莫地平片粉末溶于2 mL的0.9%生理盐水灌胃,给药剂量16.2 mg/kg,1次/d;联合用药组给予尼莫地平片+脑泰通组方浸膏灌胃,剂量同前,1次/d。各组均连续干预7 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 NIHSS评分测定 根据KWAH等[10]制定的NIHSS评分标准,在干预后1 d、3 d、7 d分别进行NIHSS评分测定:缓慢抓起大鼠尾部,距离实验台约10 cm,前爪趴于台面,轻柔推动其前肢大关节直至向前滑动2 cm,选择方向测试数次,脑组织未损伤大鼠在反方向可感受到抵抗,脑组织损伤大鼠则呈偏瘫状前爪屈曲。正常记为0分;前爪屈曲,抓尾试验阳性记1分;前推抵抗程度明显下降,前爪屈曲记2分;自发单侧转圈,爬行时出现偏瘫记3分。

1.2.3.2 脑组织含水量测定 各组大鼠在最后1次干预2 h后处死,完整取出脑组织,于精准天平称取脑组织湿重,后置于烘箱烘干后称取脑组织干重,脑组织含水量(%)=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。

1.2.3.3 脑组织缺血体积百分比测定 取出完整的脑组织后以大脑冠状沟线进行切片,放入1%的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride,TTC)染色液中孵育20 min,健康脑组织表现为鲜红色,缺血脑组织表现为白色,借助Image Pro Plus软件分析脑组织缺血体积百分率,脑组织缺血体积百分率(%)=脑组织切片缺血区域面积/脑组织切片总面积×100%。

1.2.3.4 免疫组织化学法染色 根据说明书步骤进行操作:脱蜡后进行封闭,添加一抗、二抗,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色,进一步脱水、封片,随机选取5个视野进行分析,用Image Pro Plus 6.0软件计算平均光密度值(Average Optical Density,AOD)。

1.2.3.5 蛋白质免疫印迹检测大鼠脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表达水平 提取各组大鼠脑组织总蛋白,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)后将蛋白置于聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,5%脱脂奶粉完全封闭孵育60 min,添加一抗抗体FoxO3a(1∶1 000),HIF-1α(1∶1 000),NF-κB(1∶1 000),BDNF(1∶1 000),4 ℃环境下静置12 h,弃去一抗,洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜3次,每次5 min。室温孵育二抗2 h,洗涤后弃去二抗,TBST洗膜3次,每次5 min。显色后以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)作为内参,计算各蛋白的灰度比值。

1.2.3.6 实时定量PCR检测大鼠脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB和BDNF的mRNA表达水平 提取大鼠脑组织总RNA,逆转录为cDNA,特异性扩增FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF。反应条件为95 ℃,10 min变性;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;40次循环。采用2-△△Ct法计算各蛋白的表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠NIHSS评分比较 假手术组大鼠未发现明显的神经功能缺损。对各组大鼠于干预后1 d、3 d、7 d分别进行NIHSS评分,模型对照组大鼠的NIHSS评分均随着时间推移而升高,存在明显的时间推移效应,而阳性药物组、中药组、联合用药组大鼠的NIHSS评分均随着时间推移而降低,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中联合用药组大鼠在不同时间点的NIHSS评分均低于阳性药物组与中药组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组局灶性脑缺血再灌注大鼠模型NIHSS评分比较分,n=10)

2.2 各组大鼠脑组织含水量及缺血体积百分率比较 假手术组的脑组织含水量显著低于模型对照组(P<0.05);与模型对照组比较,阳性药物组、中药组、联合用药组大鼠的脑组织含水量及缺血体积百分率均显著降低(均P<0.05),其中联合用药组大鼠的脑组织含水量及缺血体积百分率均显著低于阳性药物组与中药组(均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑组织含水量及缺血体积百分率比较

2.3 各组大鼠脑组织凋亡因子水平比较 假手术组Bax、Bcl-2均处于较低水平,在造模各组中,模型对照组Bax表达水平最高,中药组、阳性药物组、联合用药组Bax表达水平依次降低;模型对照组Bcl-2表达水平最低,中药组、阳性药物组、联合用药组Bax表达水平依次升高。假手术组大鼠脑组织Bax、Bcl-2平均光密度值、Bax/Bcl-2值显著低于模型对照组(均P<0.05);与模型对照组比较,阳性药物组、中药组、联合用药组的脑组织Bax平均光密度值、Bax/Bcl-2值显著降低(均P<0.05),其中联合用药组的降低程度最大(P<0.05);Bcl-2平均光密度值显著升高(P<0.05),其中联合用药组的升高程度最大(P<0.05),提示脑泰通组方可有效抑制脑组织凋亡,对脑组织具有保护作用。见图1,表4。

图1 大鼠脑组织Bax、Bcl-2蛋白表达情况(DAB染色,×200)

表4 各组大鼠脑组织凋亡因子水平比较

2.4 各组大鼠脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表达水平比较 与假手术组比较,模型对照组脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表达水平均显著升高(均P<0.05);与模型对照组比较,阳性药物组、中药组、联合用药组的脑组织NF-κB蛋白及mRNA的表达水平显著降低(均P<0.05),其中联合用药组的降低程度最大(P<0.05),FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表达水平显著升高(均P<0.05),其中联合用药组的升高程度最大(P<0.05)。见图2,表5～6。

图2 各组大鼠脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表达水平

表5 各组大鼠脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表达水平比较

表6 各组大鼠脑组织FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF mRNA表达情况

3 讨论

缺血性脑血管疾病的临床发病率较高并呈现出逐年增加趋势,临床预后较差,致残率较高,是目前亟须解决的重大卫生问题[2]。中医学认为,缺血性脑血管疾病属于“本虚标实”之证,其中病机关键在于“气虚血瘀,脑络受阻”。气虚使血行不利,血行滞缓,日久成瘀,阻塞脑络,最终发为本病。现代医学认为,缺血性脑血管疾病的主要发病机制为脑组织内血管被血栓堵塞、血液循环受限造成局部脑组织氧分及营养供应不足,诱发脑组织神经一系列的级联反应与细胞凋亡,导致神经生物信号紊乱及功能障碍,并由此产生的致残、致死等不良事件,严重威胁着患者的健康与生命,此外导致的后遗症造成患者的生命质量显著下降,预后不佳[11-14]。XUE等[15]针对缺血性脑血管疾病的中西医结合研究进展显示,气虚血瘀主要体现在脑组织内血栓形成,或动脉内管腔狭窄,导致血液循环速度减慢,同时各种缺氧级联反应持续发生,炎症介质释放,极大地损伤脑组织及神经的形态与功能。因此,中医治疗缺血性脑血管疾病的总体原则为益气活血、护脑安神。由于缺血性脑血管疾病的特殊性及复杂性,针对本病发现新的治疗手段已成为医学界的研究热点。脑泰通组方化裁于中医经典方剂补阳还五汤,具有益气活血、护脑安神的功效。现阶段,中医药因其多作用靶点、多信号通路、多层次、综合性的整体调控作用备受瞩目[16]。

本研究采取MCAO法构建局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,本造模方法属于比较成熟、稳定的造模方法,为本研究的实施提供了动物模型基础。研究显示,缺血性脑血管疾病的发生发展存在多种复杂的机制,涉及到细胞信号紊乱、细胞凋亡、组织重构、缺氧级联反应、炎症反应、氧化应激等生物学过程[17]。本研究结果显示,脑泰通组方能有效保护局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的脑组织损伤,改善局部脑缺血,抑制脑组织细胞凋亡及炎症反应,同时能够有效促进FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表达水平,抑制NF-κB蛋白及mRNA的表达水平。FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信号通路是近年来发现的缺血性脑血管疾病的重要信号通路,其密切参与到脑组织内细胞增殖、凋亡、分化、缺氧反应及炎症反应过程中,对调控脑组织及神经细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程具有重要作用[18]。

FoxO3a被称为“人类长寿的密码”,广泛存在于人体组织中,与人类衰老表型密切相关[19],TAN等[20]研究显示,FoxO3a属于人体内非常重要的能量代谢调控蛋白,其在人体脑组织、心肌组织等高能量代谢的组织内的表达量显著高于其他部位;LI等[21]研究表明,FoxO3a能够对应激性代谢过程进行调节,其表达水平上升能够有效保护人体组织免受氧化应激及炎症反应的损害,尤其是脑组织等需氧量较多的高能量代谢部位。在缺血性脑血管疾病中,存在着极为复杂的缺氧级联反应以及组织重构,HIF-1α属于代谢调节蛋白,RAHMATI等[22]研究显示,在缺血性脑血管疾病中HIF-1α能够有效调节缺血缺氧时脑组织细胞内的氧平衡,维持在缺氧缺血状态下的内环境稳态,并调节细胞适应缺氧。BDNF是人体内最重要的神经营养因子,其对脑组织及神经细胞存在显著的保护效应[23],同时BEMBENEK等[24]研究显示,BDNF对脑组织及神经细胞的重构、细胞生长再生具有重要的维持和促进作用。此外,CHEN等[25]研究显示FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信号通路对于脑组织缺血后的脑血管复通、重构血管通道、细胞骨架蛋白构建等存在重要的调控功能,这对于缺血性脑血管疾病的治疗与康复具有重要意义。研究该信号通路在缺血性脑血管疾病的具体作用机制,为本病的治疗提供了新的思路及方法,是较为值得去尝试的重要研究方向。

综上所述,脑泰通组方契合缺血性脑血管疾病的病因病机,能有效保护局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的脑组织损伤,改善局部脑缺血,抑制脑组织细胞凋亡及炎症反应,并与西药联用存在较明显的“协同增效”作用,其作用机制可能与脑泰通组方调控FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信号通路相关蛋白表达相关。本研究结果凸显了中西医结合治疗缺血性脑血管疾病的独特优势,脑泰通组方的中药材均为常见药物,方便易得,价位合理,操作简单,适于临床进一步推广,也为中西医结合治疗缺血性脑血管疾病提供了新的思路与方法。

利益冲突声明:无。