徐源 赫丁轩

摘要 为探索超声波辅助提取艾叶黄酮的最佳工艺及其抗氧化活性，以黄酮提取率为指标，采用单因素试验分别考察乙醇浓度、料液比、超声时间对艾叶黄酮提取量的影响，再通过响应面试验得到最佳提取工艺。结果表明：艾叶黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度62.78%，料液比1∶30.29（g/mL），提取时间63.46 min，按上述最佳工艺得到黄酮提取率为12.88%；抗氧化活性分析表明艾叶黄酮提取液有一定的抗氧化活性，对DPPH自由基和羟基自由基的半抑制浓度（IC50）分别为0.084、0.217 mg/mL。

关键词 艾叶黄酮；超声辅助提取；响应面法；抗氧化活性

中图分类号 TQ460.7 文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）14-0043-06

艾叶别名艾蒿、灸草，为菊科植物艾的干燥叶[1]，主要有效成分包括挥发油、黄酮类、鞣质类和多糖等[2]。现代药理试验表明，黄酮类物质不但具有降血压、降血脂、缓解心血管疾病、抗菌消炎等作用，还具有抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力等生理活性作用[3]，已被广泛应用于医药、食品等领域。艾叶的综合开发及利用已逐渐成为当前的研究热点[4]。本文主要对艾叶中的有效成分黄酮进行研究，对艾叶黄酮的提取工艺进行优化，并在最佳提取条件下研究艾叶黄酮的抗氧化活性，为艾叶的深度开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

艾叶，南阳老艾岭股份集团有限公司；芦丁标准品，合肥巴斯夫生物科技有限公司；无水乙醇，郑州派尼有限公司；氢氧化钠（分析纯）、亚硝酸钠（分析纯）、硝酸铝（分析纯）、维生素C（分析纯）、DPPH，福州飞兴生物科技有限公司；H2O2，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；恒温水浴锅，浙江聚能仪器设备有限公司；超声波提取仪，长沙明杰仪器有限公司；高速粉碎机-6202型，河南立鑫机械设备有限公司；高速离心机，南京伊若达仪器有限公司；双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；循环水式多用真空泵，南京嘉美伦科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制  根据李学玲等[5]的方法，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定，得到芦丁标准曲线方程，如图1所示。结果表明，芦丁标准品在0.005～0.025 mg/mL范围内，线性关系良好。

1.3.2 艾叶黄酮提取液制备  艾叶黄酮提取液制备方法[6]：将干燥的艾叶粉碎制成粉末，精确称取1.0 g艾叶粉末，然后按照一定的料液比加入不同浓度的乙醇溶液，超声提取，提取液7 000 r/min离心10 min，取上清液，可得艾叶黄酮提取液。

1.3.3 艾叶黄酮含量测定  将制备得到提取液用移液管移取0.5 mL置于10.0 mL带有刻度的试管中，随即加入体积分数为80%的乙醇溶液到5.0 mL刻度线处，振荡混匀后按照1.3.1的操作方法进行后续操作，最后在波长510 nm处测定其吸光度。得到的数据按照芦丁标准曲线进行计算，按照下列公式计算出艾叶黄酮的得率[7]。

式中：[C]—测得的黄酮质量浓度，单位为mg/mL；[V]—艾叶样品定容体积，单位为mL；n—稀释倍数；

m—艾叶样品质量，单位为g。

1.3.4 单因素试验设计  本试验的主要思路是研究单因素在不同梯度条件下对艾叶黄酮提取率的影响[8]。在研究乙醇体积分数作为单因素影响艾叶黄酮提取率时，设置其梯度为30%、40%、50%、60%、70%，并且设置料液比1∶20 （g/mL），提取时间30 min；研究料液比梯度1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40时，设置乙醇浓度30%，提取时间30 min;最后研究提取时间梯度30、40、50、60、70 min时，其他2个单因素此时设置为乙醇浓度60%、料液比1∶20（g/mL）。

1.3.5 响应面试验设计  根据单因素试验得到的数据，根据Box-Behnken进行设置表格（表1），通过Design-Expert 13.0软件，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）3个因素，设计出3因素3水平共17组试验，包括5组中心试验，通过响应面试验数据分析[9]得到最佳的艾叶黄酮提取工艺数据，优化艾叶黄酮的提取工艺。

1.3.6 艾叶黄酮对DPPH自由基清除分析  按照响应面优化得到的最优条件提取艾叶黄酮[10]，得到的艾叶黄酮提取液用60%乙醇进行稀释，配制成

5个浓度梯度黄酮提取液。取2.0 mL质量浓度为0.05 mg/mL的DPPH溶液，与2.0 mL不同浓度的艾叶黄酮提取液混合摇匀，室温下避光反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度A，按下列公式计算其对DPPH自由基的清除率[11]。

式中：A0—DPPH和蒸馏水混合液的吸光度；A1—样品液和DPPH混合液的吸光度；A2—蒸馏水和样品混合后得到的吸光度。

1.3.7 艾叶黄酮对羟基自由基清除分析  该试验通过水杨酸法研究艾叶黄酮对羟基自由基的清除率[12-13]。按照响应面法得到的最优条件提取艾叶黄酮，得到的艾叶黄酮提取液用60%乙醇进行稀释，配制成5个浓度梯度黄酮提取液。然后分别配制5 mmoL/L的硫酸亚铁溶液、水杨酸溶液和过氧化氢溶液。分别取不同濃度的艾叶黄酮提取液置于不同试管中，先加入1 mL硫酸亚铁溶液，然后分别加入2 mL过氧化氢和水杨酸溶液。然后将上述提取液放置在37℃水浴锅中水浴加热30.00 min，使用紫外可见分光光度计在510 nm处测量样品溶液的吸光度；最后用相同质量浓度梯度的维生素C作为样品对照，根据下列公式求艾叶黄酮对羟基自由基的清除率。

式中：A0—蒸馏水和3种试剂混合得到的吸光度；A1—样品液和3种试剂混合得到的吸光度；A2—3种试剂（过氧化氢替换为蒸馏水）和样品液混合得到吸光度。

1.4 数据处理

上述所得实验数据经过处理后作图，使用Design-Expert 13.0软件将数据进行系统分析，P<0.05表示为显著差异，P<0.01表示为极显著差异，P>0.05，影响不显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对艾叶黄酮提取率的影响  由图2可知，当乙醇浓度为60%时，艾叶黄酮提取率最大。在乙醇体积分数60%之前，艾叶黄酮的提取率和乙醇体积分数呈正相关，超过60%以后，提取率和乙醇体积分数呈负相关。可能是物质极性的差异导致这种结果的产生，艾叶黄酮更容易溶于该体积分数的乙醇溶液，使得黄酮的提取率达到最大。经过分析，最适乙醇浓度为60%。

2.1.2 料液比对艾叶黄酮提取率的影响  由图3可知，当料液比为1∶30（g/mL）时，艾叶黄酮提取率最大。在这个料液比之前，提取率随着料液比的增大而上升；在此之后，则随着料液比的增大而降低。原因是随着溶剂量的增加，在超声作用下溶剂更易渗透进入到细胞中，有利于艾叶中的黄酮溶出。而过量的溶剂会降低超声效率，使艾叶中的黄酮不易充分溶出。因此，最适料液比为1∶30。

2.1.3 提取时间对艾叶黄酮提取率的影响  由图4可知，当提取时间为60 min时，艾叶黄酮提取率最大。在此之前，提取率随着提取时间的增加而增加，在此之后，提取率随着提取时间增加而降低，60 min之前可能是因为随着提取时间增大，艾叶结构被彻底破坏，目标物质溶出增多；60 min后，黄酮提取率表现出与之前相反的趋势，可能是因为提取时间过长导致黄酮的化学性质发生了改变，造成提取率下降。因此，最佳时间为60 min。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 试验结果与建模有效性分析  本试验以单因素试验为基础，建立了3因素3水平的响应面优化试验，根据Box-Behnken原理并利用Design-Expert 13.0软件进试验结果分析，见表2。数据方差分析结果见表3。

应用Design-Expert 13.0软件对表2试验结果进行拟合分析，得到二次多项回归方程：

Y=12.78+0.57A+0.341 3B+0.486 2C+0.282 5AB-0.027 5AC-0.18BC-2.13A2-1.44B2-0.852 5C2

由表3可知：归回模型P<0.000 1，达极显著水平；失拟项P=0.065 3，不显著；决定系数R2=0.996 9，表明该模型拟合度良好；矫正决定系数R2Adj=0.992 6，表明约99.69%的相应值（Y）变化可以用该模型解释。结果表明，艾叶黄酮提取率影响因素为乙醇体积分数（A）>提取时间（C）>料液比（B）。并且通过对表中数据显著性（P）的分析，可得到一次项A和C，二次项A2、B2、C2的影响极显著；交互项AB和BC的P<0.05，影响显著，交互项AC的P>0.05，影响不显著。综上分析，该响应面试验模型比较可靠。

根据响应面数据模拟结果，绘制出三维响应面图和等高线图，见图5。3D响应面图呈现凸起峰值，峰值与最低处的趋势越陡峭，此因素对响应面影响越大，表明该交互项对响应值的影响越大，2D等高线图呈椭圆状且分布集中时，则说明两个单因素交互作用达到显著。图中乙醇体积分数（A）和料液比（B）、提取时间（C）和料液比（B）的交互作用显著，乙醇体积分数（A）和提取时间（C）的交互作用不显著，3个单因素的交互作用与表3（方差结果）分析一致。

2.2.2 最佳工艺条件验证  通过Design-Expert 13.0软件对所建模型进行参数优化，得出艾叶黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度62.78%，料液比1∶30.29，提取时间63.46 min，提取率12.88%。考虑试验的可操作性，调整最佳工艺参数为乙醇浓度63%，料液比1∶30 （mg/mL），提取时间64 min，进行3次平行试验，得到黄酮提取率为（12.86±0.036）%，得到的试验结果与响应面理论预测值比较，无显著性差异（P>0.05），表明该拟合模型可靠。

2.3 艾叶黄酮抗氧化活性分析

2.3.1 艾叶黄酮对DPPH自由基的清除作用  由图6可知，DPPH自由基的清除作用随着艾叶黄酮提取液浓度的增加而增加。通过对DPPH自由基清除率的线性方程分析，可以计算出艾叶黄酮提取液的半抑制浓度（IC50）为0.084 mg/mL。从图6还可以看出，维生素C对DPPH自由基的清除能力要强于艾叶黄酮提取液，并且清除率均保持在90%以上。

2.3.2 艾叶黄酮对羟基自由基的清除作用  由图7可知，随着艾叶黄酮提取物质量浓度的增加，对羟基自由基清除能力呈现逐渐递增的趋势，在质量浓度大于0.1 mg/mL后清除率递增趋于平缓，并且通过艾叶黄酮对羟基自由基清除率的线性方程，可以计算出艾叶黄酮的半抑制浓度（IC50）为0.217 mg/mL。在质量浓度为0.050～0.135 mg/mL，艾叶黄酮羟基自由基清除能力明显高于维生素C的自由基清除能力，在质量浓度为0.135 mg/mL时，艾叶黄酮的羟基自由基清除能力与维生素C相持平，但是在此之后，艾叶黄酮的自由基清除率低于维生素C。

3 结论

本研究主要对艾叶黄酮的提取工艺进行优化，得到艾叶黄酮提取的最佳单因素条件为乙醇体积分数60%、料液比1∶30 （g/mL）、提取时间60 min；在单因素试验的基础上，通过Design-Expert 13.0软件的响应面优化试验得出艾叶黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度62.78%，料液比1∶30.29 （g/mL），提取時间63.46 min，并且在此工艺条件艾叶黄酮的提取率达到12.88%。在最佳提取工艺下得到艾叶黄酮提取液并进行抗氧化活性分析，其对DPPH自由基、羟基自由基的清除率的IC50值分别为0.084、0.217 mg/mL，表明艾叶黄酮提取液具有良好的抗氧化活性。本研究结果可为艾叶资源的深度开发利用提供参考。

参考文献

[1] 焦春霞，王国昌. 响应面优化艾叶精油的提取工艺研究[J]. 现代食品，2022，28（9）：47-50，76.

[2] 朱平平，覃智恒，彭慧倩，等. 艾叶中多糖和黄酮联合提取工艺及抗氧化性研究[J]. 广州化工，2022，50（23）：66-69，98.

[3] 趙彦巧，卜凡真，王月，等. 紫苏叶黄酮超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性[J]. 食品研究与开发，2023，44（6）：146-152.

[4] 任美燕. 红薯叶黄酮超声提取工艺优化、抗氧化及抑菌研究[J]. 中国食品添加剂，2023，34（1）：224-232.

[5] 李学玲，许苑南，龙佳敏，等. 黄果茄总黄酮的提取工艺优化与体外抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发，2020，41（23）：143-149.

[6] 刘子瑄，孔馨逸，陈璐，等. 汉麻叶黄酮提取工艺及抗氧化活性研究[J]. 中国调味品，2022，47（8）：187-190.

[7] 杜娟，陈梓馨，解春艳. 核桃叶的黄酮类物质提取及其抗氧化活性[J]. 北方园艺，2022（19）：94-99.

[8] 李东泽，付琳，任书杉，等. Box-Behnken响应面法优化阿托伐他汀钙类脂囊泡处方工艺[J]. 中国药业，2023，32（9）：36-42.

[9] 龙旭，王蕾萌，龚莉，等. 丹参总黄酮提取工艺的优化及其抑菌活性研究[J]. 化学与生物工程，2023，40（1）：25-29，47.

[10] PARK N，CHO S D，CHANG M S，et al. Optimization of the ultrasound-assisted extraction of flavonoids and the antioxidant activity of Ruby S apple peel using the response surface method[J]. Food Science and Biotechnology，2022，31（13）：1667-1678.

[11] 任倩倩，高朋，马致静，等. 响应面法优化超声辅助提取北柴胡黄酮工艺及抗氧化活性[J]. 北方园艺，2023（5）：93-100.

[12] ZHANG PENG，SONG YUWEN，WANG HONGLING，et al. Optimization of flavonoid extraction from Salix babylonica l. buds， and the antioxidant and antibacterial activities of the extract[J]. Molecules，2022，27（17）：1412-1419.

[13] 龚频，翟鹏涛，张梦璇，等. 野葛总黄酮的提取工艺优化及抗氧化活性研究[J]. 中国酿造，2022，41（10）：172-176.

（责编：张宏民）