叶劲松 梁子聪

(黔南民族医学高等专科学校,贵州 都匀 558000)

膝骨性关节炎(KOA)是临床骨科常见的疾病之一,以中老年发病为主,女性高于男性〔1〕。KOA的主要病理特征是关节软骨退变、软骨下骨硬化、滑膜炎症等〔2〕。KOA除引起膝关节疼痛外,后期可使膝关节畸形、关节功能丧失,严重影响患者的生活质量。动物实验是研究临床疾病发生、发展及防治方法的重要途径。建模方法、病变特点相似性、建模时间等是一直以来KOA动物模型研究关注的焦点问题〔3〕。常用的KOA建模方法有:关节腔内注射药物法,如木瓜蛋白酶、胶原酶、碘乙酸钠;关节制动法,如石膏固定法、外固定支架固定法;诱导法,如卵巢切除法;外科手术法,如Hulth法、改良Hulth法、前交叉韧带离断术、半月板切除术等〔4〕。本研究通过比较卵巢切除法、木瓜蛋白酶法、改良Hulth法3种方法在不同时间节点血清炎症因子、病理表现及关节软骨胶原蛋白(Collagen)Ⅱ表达,了解KOA不同造模方法的造模效果及特点。

1 资料与方法

1.1仪器、药品与试剂 仪器:MR-96A型酶标仪(深圳迈瑞),ASP300 S型全封闭式组织脱水机(德国Leica)、RM2265型全自动轮转式切片机(德国Leica)、HI1210型摊片机(德国Leica)、DM750型光学显微镜(德国Leica)。药品与试剂:木瓜蛋白酶(北京索莱宝),白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(北京诚林生物公司),封闭液(武汉博士德),CollagenⅡ多克隆抗体(北京百奥思科),通用型SP试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色盒(北京中杉金桥),其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验动物与分组 清洁级雌性SD大鼠80只,体质量(200±20)g,由长沙天勤生物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2014-0010。适应性饲养1 w,分笼饲养,不限制饮食。采用随机数字表法分别设立空白对照组(6、10 w)、卵巢切除法组(6、10 w)、木瓜蛋白酶法组(6、10 w)、改良Hulth法组(6、10 w),每组10只。

1.3动物造模 所有SD大鼠于相同环境及饲喂条件下适应性喂养1 w,见各组大鼠在进食量、精神状态、活泼程度等大体情况无差别后开始造模建立膝骨关节炎模型。具体操作步骤如下:动物麻醉:所有造模大鼠均采用3%戊巴比妥钠1 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉。卵巢切除法〔5〕:麻醉生效后,无菌条件下由双侧肋脊角下后1 cm处纵行切口入后腹腔,缓慢提拉出卵巢及附近脂肪垫,仔细剥离,结扎输卵管,结扎卵巢动静脉,切除双侧卵巢后复位关闭。木瓜蛋白酶关节腔内注射法〔6〕:麻醉生效后,轻轻弯曲右膝关节,自膝关节两侧膝眼进针,刺入关节腔内,先回抽,确定针头于关节腔内后,将提前配置好的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml注入关节腔内。拔针后以灭菌棉球轻压针眼2 min,避免木瓜蛋白酶溶液溢出。被动屈伸膝关节10次左右,使所注射溶液能均匀浸润膝关节腔内。间隔3 d后重复此方法1次,共进行3次注射。改良Hulth法〔7〕:麻醉生效后,无菌条件下取右膝关节内侧纵切口长约2 cm,显露膝关节,然后切断前交叉韧带及内侧副韧带,完整切除内侧半月板,保留关节软骨面。术后不固定伤肢,自由活动,可适当给予抗生素预防感染。待麻醉苏醒后,造模大鼠归笼喂养。空白对照组:不进行任何处理。

1.4标本采集方法 根据实验计划,各组大鼠分别于造模后第6周、第10周分批次处死,每组10只。麻醉处死后,腹主动脉剪开取血,所得血液注入无菌EP管中离心(3 000 r/min,4 ℃)10 min,吸取上清液后置于-20 ℃冰箱中待测。取大鼠右侧膝关节关节软骨及软骨下骨标本,置于4%多聚甲醛中固定,10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙,矢状位取材,常规脱水石蜡包埋,切片备用。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-6、TNF-α、基质金属蛋白酶(MMP)-3的含量 具体操作参照说明书。

1.6镜下观察切片行苏木素-伊红(HE)染色,于光学显微镜下观察关节软骨的组织结构是否完整、软骨细胞数量的多少和潮线完整与否。按改良Mankin标准经行病理评分〔8〕。分组标准为:正常:0～1分;轻度:2～5分;中度:6～9分;重度:10～14分。

1.7免疫组化观察膝关节软骨CollagenⅡ表达 切片脱水后,予柠檬酸高温高压8 min行抗原修复;滴加阻断剂一滴,置湿盒内室温孵育10～30 min;每张切片滴加一抗后置湿盒内4 ℃孵育过夜;再滴加辣根过氧化物酶标记二抗,置湿盒内37 ℃孵育30 min,滴加DAB显色液显色后,脱水、透明、中性树胶封片。免疫组化切片置于显微镜下,每例取临近软骨退变区随机选取8个不重叠视野,图形软件测定阳性颗粒光密度值与底面光密度值之比,取每张切片的均值作为每例的测量值。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行配对样本t检验、独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组不同时间点血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量比较 造模6 w时,与空白对照组对比,其他各组血清IL-6含量明显增高(P<0.05);与卵巢切除法组比较,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组血清IL-6含量明显增高(P<0.05);与空白对照组、卵巢切除法组对比,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组血清TNF-α、MMP-3含量明显增高(P<0.05),而空白对照组与卵巢切除法组对比未见明显差异(P>0.05)。造模10 w时,与空白对照组对比,卵巢切除法组血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量未见明显差异(P>0.05);而与空白对照组、卵巢切除法组比较,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量明显增高,且改良Hwlth法组TNF-α、MMP-3含量明显高于木瓜蛋白酶法组(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量比较

2.2各组不同时间点膝关节镜下病理表现和改良Mankin病理评分比较 造模6、10 w时,空白对照组膝关节镜下见关节软骨光滑平整,软骨排列、形态细胞正常,软骨基质无明显减少,潮线完整。造模6 w时,卵巢切除组膝关节镜下见关节软骨光滑平整,软骨排列、形态细胞正常,软骨基质无明显减少,潮线完整。造模10 w时,卵巢切除法组膝关节镜下见软骨关节面尚平整,软骨细胞部分退化、软骨基质减少。造模6 w时,木瓜蛋白酶法组和改良Hulth法组膝关节镜下见软骨关节面变粗糙,软骨细胞增生活跃、软骨基质减少。造模10 w时,木瓜蛋白酶法组和改良Hulth法组膝关节镜下见软骨关节面明显粗糙、部分关节软骨糜烂、缺损,软骨细胞及软骨基质明显减少,但改良Hulth法组病理表现更明显。造模6、10 w时,与空白对照组对比,卵巢切除法组改良Mankin评分无明显差异(P>0.05);与空白对照组、卵巢切除法组比较,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组改良Mankin评分明显升高(P<0.05);与木瓜蛋白酶法组比较,改良Hulth法组改良Mankin评分明显升高(P<0.05)。见表2、图1。

表2 各组不同时间点改良Mankin评分、膝关节软骨CollagenⅡ免疫组化结果比较

2.3各组不同时间点膝关节软骨CollagenⅡ免疫组化比较 造模6 w时,与空白对照组对比,卵巢切除法组膝关节软骨CollagenⅡ表达无明显差异(P>0.05);与空白对照组、卵巢切除法组比较,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组膝关节软骨CollagenⅡ表达明显降低(P<0.05)。造模10 w时,与空白对照组对比,卵巢切除法组膝关节软骨CollagenⅡ表达无明显差异(P>0.05);与空白对照组、卵巢切除法组比较,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组膝关节软骨CollagenⅡ表达明显降低(P<0.05);与木瓜蛋白酶法组比较,改良Hulth法组膝关节软骨CollagenⅡ表达明显更低(P<0.05)。见表2、图2。

图2 各组不同时间点膝关节软骨CollagenⅡ阳性表达(免疫组化染色,×400)

3 讨 论

KOA是中老年人群常见疾病,致残率高,导致其高致残率的原因是膝关节滑膜反复的炎症反应,关节软骨退变、关节间隙狭窄逐渐加重,慢性骨质增生及骨赘形成,最后导致关节变形、僵硬,功能丧失〔9〕。无论性别、年龄、创伤、肥胖或者先天性因素引起,KOA的发生进展机制离不开细胞因子持续的炎症反应〔10〕。细胞因子既可以与关节软骨细胞表面的靶分子结合,从而激活软骨细胞内信号分子通路,调节软骨细胞的生理功能,也可以参与生物学、生物化学的反馈作用,形成一系列复杂的炎症网络体系,导致软骨细胞死亡及软骨基质破坏〔11〕。软骨细胞是维持关节软骨外基质合成与释放的重要细胞〔12〕。随着年龄增长,软骨细胞生成不足或凋亡过多,软骨弹性蛋白多糖及胶原不断地减少,打破了细胞外基质分解和代谢的动态平衡,关节软骨层变脆而脱落〔13〕。此外,当膝关节受到外伤时,关节软骨的压力感受器兴奋,诱导软骨细胞基因表达,释放细胞因子,产生关节炎症反应〔14〕。

KOA的发病是由多种细胞因子共同作用的结果,如IL、TNF、趋化因子等细胞因子家族均在KOA炎症过程发挥重要作用〔15〕。其中,IL家族包括了促炎性和抑炎性细胞因子。相关研究显示,IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17等细胞因子与KOA发病关系密切〔16〕。IL-1β可以刺激成纤维细胞分泌IL-6、IL-8,促进关节滑膜发生炎性反应〔17〕。同时,IL-1β和TNF-α可协同作用,使腺苷酸活化酶活动减弱,加快软骨细胞分解代谢〔18〕。IL-1β和TNF-α还能够诱导MMP-3和MMP-13的表达,从而诱导关节软骨CollagenⅡ及基质的分解〔19〕。相反,IL-10等抑制性IL可以抑制炎性细胞因子的活性表达,对软骨具有保护作用〔19〕。MMP家族是KOA发病的关键细胞因子。该家族由基质降解酶(MMP-3、MMP-10、MMP-11)、胶原蛋白酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)、膜类MMP(MMP-15、MMP-16、MMP-24)等组成〔20〕。MMP是降解软骨基质最重要的酶。MMP可促进诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2分泌,致使软骨基质的合成代谢降低,同时分解代谢增强,加快软骨基质降解〔21〕。研究表明,MMP-3高表达可激活MEK、EPK、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多条炎症反应信号通路,参与骨性关节炎发病的整个过程〔22〕。

目前KOA模型的建立分为诱导型、自发型、转基因型3大类型,然而人为干预诱导的KOA模型是目前最常使用的造模方式〔23〕。本研究结果可能与卵巢切除术并非对KOA造模过程中血清炎症因子和膝关节局部的影响直接相关。有研究认为,卵巢切除术后,大鼠体内雌激素水平显著下降,骨质合成代谢减慢,骨质分解代谢增强,导致骨量减少而发生骨质疏松〔24〕。由于软骨下骨量减少,关节逐渐失稳,软骨磨损从而诱发关节炎。本文造模方法与绝经后妇女骨质疏松并膝关节炎发病机制相似,但是目前并没有直接研究结果表明骨质疏松与骨性关节炎发生的先后顺序及相关的发病机制。本研究应用卵巢切除术在建模第10周时仍然未能成功建立稳定的KOA模型。不少学者在采用卵巢切除术的基础上,联合糖皮质激素、驱赶运动建立骨性关节炎模型〔25〕。马文娟等〔26〕将新西兰大白兔双侧卵巢切除,术后肌注甲泼尼松龙琥珀酸钠1 mg/(kg·d)连续注射1个月,2个月后得到稳定的骨质疏松并骨性关节炎模型。李楠等〔27〕比较单纯卵巢切除术、卵巢切除术+弱驱赶、卵巢切除术+强驱赶等方法的造模效果,3个月后改良Mankin病理评分结果显示,卵巢切除术+强驱赶组评分结果显著高于单纯卵巢切除术组与卵巢切除术+弱驱赶组,说明造模效果与卵巢切除术后实验动物驱赶运动强度密切相关。糖皮质激素联合驱赶运动可能加速了机体低雌激素水平下的骨质分解代谢,导致骨量显著减少,加快了骨性关节炎形成的过程。木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶,可以抑制软骨细胞合成,并能促进软骨基质中的蛋白多糖分解,加速了关节软骨基质的退行性变〔28〕。高浓度木瓜蛋白酶还能直接损伤软骨细胞,抑制软骨细胞再生修复〔29〕。段文秀等〔30〕分别在第1天、第4天时向大鼠膝关节腔内注射2%木瓜蛋白酶0.15 ml,结果显示该方法成功形成早期KAO模型需要4～6 w。何俊君等〔31〕第1、4、7天时用相同方法制造模型,浓度增加为4%,2 w即可成功制备早期膝骨关节炎模型,说明膝关节破坏程度与木瓜蛋白酶注射的浓度和剂量相关。本研究中,炎症因子浓度下降可能是与木瓜蛋白酶注射后炎症反应出现峰值后有所缓和相关,与木瓜蛋白酶注射的浓度和剂量影响膝关节破坏程度的结论相一致。第10周时Mankin病理评分结果升高可能与关节软骨及周围软组织破坏,关节内机械力线改变,引起膝关节不可逆的退行性变有关。膝关节手术制造KOA动物模型常用方法有传统Hulth法(前后交叉韧带切断+内侧副韧带切断+内侧半月板切除)、改良Hulth法(前交叉韧带切断+内侧副韧带切断+内侧半月板切除)、前交叉韧带切断术、单纯内侧半月板切除术、膝关节软骨损伤术〔32〕。其主要原理是直接造成膝关节结构损伤及破坏关节稳定性使得关节面受力失衡,加快膝关节退变而诱发骨性关节炎〔33〕。杨黎黎等〔34〕应用传统Hulth法建立大鼠KOA造模,发现于手术后第2、4、8周分别成功建立了轻度、中度、重度KOA模型。肖春苟等〔35〕应用改良Hulth法+驱赶法制造兔KOA模型,结果显示4 w后成功建立动物模型。沈鹏等〔36〕和欧慧瑜等〔37〕分别用前交叉韧带切断法和关节软骨损伤法建立KOA模型,实验结果均显示8 w后可得KOA模型。通过上述实验结果可推断膝关节手术制造KOA模型的效果和时间与手术方法造成膝关节的创伤程度相关,但上述方法在不同时间节点膝关节炎严重程度的比较尚需进一步实验证实。本研究结果提示,改良Hulth法组建立的KOA动物模型在炎症反应和膝关节病理改变程度等造模效果方面优于相同时间节点的木瓜蛋白酶组。这可能与改良Hulth法所造成的持续性膝关节不稳定性相关。本研究表明,木瓜蛋白酶法和改良Hulth法均可在第6周时快速、有效地建立KOA模型。而改良Hulth法随着造模时间的增加,在炎症反应表现更加持久和膝关节病理改变严重程度更高。通过单纯卵巢切除术法建立KOA动物模型效果不明显,需要联合糖皮质激素和驱赶运动增加建立KOA模型的效果与效率。

综上,通过不同的方法制备的KOA模型在疾病发展过程中,炎症反应、膝关节病理表现等方面各不相同。由于KOA 病因相当复杂,其疾病的形成与多种因素相关,所以没有一种动物模型能够满足所有实验研究。研究者应当结合患者的病因病机、关节力学特征等方面的特点选择合适动物模型造模方法,以便在实验过程中获得与临床相似的实验数据。