马黎丽 代俊伟 王卫国

(阜阳市人民医院检验科,安徽 阜阳 236000)

肺炎克雷伯菌(KPN) 是临床常见的医源性条件致病菌,具有较强的致病性,可引起呼吸系统、消化系统、泌尿系统等系统感染,导致肺炎、败血症、脑膜炎、肝脓肿,严重危及患者生命安全〔1,2〕。研究发现,KPN对β-内酰胺类、大环内酯类等常规抗生素具有较高耐药性,也是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的一类代表菌〔3〕。中国细菌耐药监测网统计数据显示,KPN的检出率、耐药率呈增加趋势,其中2017年克雷伯菌属的耐药菌株占比约为15%,仅次于大肠杆菌属,增加了临床治疗困难,因此研究KPN的耐药性问题具有重要意义〔4〕。近年来,KPN的高检出率和高耐药率使噬菌体疗法越来越受到临床关注,相对于抗菌药的治疗,噬菌体治疗存在一定优势〔5〕。噬菌体广泛存在于自然环境中,多与细菌伴生,其通过裂解细菌而发挥良好的抗菌效果,且对抗耐药性的细菌亦存在明显效果。最新研究发现噬菌体能够抑制宿主细菌生物膜的产生,从而对生物膜相关感染实施控制〔6〕。本研究拟回顾性分析2019～2021年临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和非产ESBLs KPN菌株的临床分布及耐药趋势,并研究噬菌体对于细菌生物膜的影响。

1 材料与方法

1.1材料 菌株从2019～2021年阜阳市人民医院老年患者送检标本(痰、血、胆汁和尿)中提取,剔除同1个患者同1个区域重复分离的菌株。

1.2采集标本及病原菌相关的培养和鉴定 标本接种在琼脂平板内,在5%浓度CO2培养箱内设置35 ℃给予24 h培养,挑取纯菌落单个,采用全自动微生物鉴定仪(型号为VITEK-32型,购自法国梅里埃公司)对病原菌实施鉴定,依据《全国临床检验操作规程》〔7〕操作。质控菌株是大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和肺炎克雷伯菌(ATCC13883),购于北京中科公司。

1.3药敏试验 利用纸片扩散法(Kirby-Bauer法)检测病原菌的耐药性,药敏纸片由英国Oxoid公司提供。用琼脂平板对细菌实施培养,在液体培养基内将平板上产生的单菌落接种扩大培养后于血琼脂平板内接种,待单菌落后长出实施相关的药敏试验,用游标卡尺对抑菌圈的直径实施检测。抗菌药物包括:阿莫西林、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南、氯霉素、庆大霉素。按照美国国家临床实验室标准化研究所标准〔8〕判断结果。

1.4泛耐药肺炎克雷伯菌(PDR-KPN)噬菌斑的形态 根据文献〔9〕方法得到高浓度的噬菌体混悬液(1×1011PFU/ml),滤器(孔径0.22 μm)过滤,4 ℃保存。取1 ml噬菌体混悬液,23 000 r/min×4 ℃离心10 min,除去上清液,加入100 μl噬菌体保存液,戊二醛溶液(3%)固定0.5 h后转移至铜网(300目)上,磷钨酸(2%,pH7.2)负染30 s,干燥处理后于JEM1400 plus透射电镜下观察噬菌体形态。

1.5噬菌体对宿主菌生物膜的作用 取噬菌体混悬液及宿主菌液(终浓度为3×108PFU/ml)。生物膜抑制实验中,根据感染复数1.000、0.100、0.010和0.001,调整噬菌体混悬液的效价,在96孔板内加入体积为200 μl的宿主菌液及20 μl噬菌体混悬液(平行3份),阴性对照组中加入200 μl宿主菌液及20 μl噬菌体保存液,空白对照组中加入220 μl LB培养液,37 ℃孵育48 h。生物膜破坏试验中,于96孔板中加入200 μl宿主菌液,37 ℃孵育48 h,每孔加入20 μl噬菌体混悬液(平行3份),噬菌体效价分别为1×106、107、108、109、1010PFU/ml,阴性对照组中加入200 μl宿主菌液及20 μl噬菌体保存液,空白对照组中加入220 μl LB培养液,37 ℃孵育48 h。采用结晶紫染色法半定量测定生物膜,除去混合液,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,每孔中加入100 μl甲醇(10%)固定15 min,风干甲醇后加入100 μl体积的结晶紫溶液(浓度为4 g/L),染色10 min后将结晶紫染色液除去,并用蒸馏水将板洗至无色。晾干后加入体积为100 μl的冰乙酸(浓度为33%),设定37 ℃在恒温培养箱中孵育30 min,充分溶解结晶紫。采用Synergy2型酶标仪(美国BioTek公司)测定每孔中的吸光度值,最大吸收波长为595 nm,最终取3次均值。生物膜抑制率=(阴性对照的吸光度值-共培养的吸光度值)/(阴性对照的吸光度值-空白对照的吸光度值)×100%,生物膜破坏率=(阴性对照吸光度值-共培养吸光度值)/(阴性对照吸光度值-空白对照吸光度值)×100%。

1.6统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1KPN临床分布特点 KPN主要分离于痰液、尿液、血液,见表1。

表1 KPN临床分布特点〔n(%)〕

2.2KPN检出率 见表2。

表2 3年KPN检出率〔n(%)〕

2.3KPN耐药情况 产ESBLs菌、非产ESBLs菌对氯霉素、阿莫西林、庆大霉素的耐药率比较高,而对亚胺培南、美罗培南的耐药率比较低,非产ESBLs对主要抗生素的耐药率均低于产ESBLs,见表3。

表3 KPN耐药性〔n(%)〕

2.4PDR-KPN噬菌斑形态 PDR-KPN噬菌斑在双层平板上呈圆形、透亮状态,噬菌斑周围有一半透明圈,大小较为均一,直径约为1.6 mm。

2.5噬菌体对宿主菌生物膜的抑制作用 0.001、0.010、0.100、1.000共同对噬菌体和宿主菌实施培养,生物膜抑制率为(44.61±4.33)%、(44.28±4.52)%、(45.32±5.28)%、(45.25±4.21)%,平均(44.87±5.54)%。

2.6噬菌体对宿主菌生物膜的破坏作用 随着噬菌体效价的升高,生物膜破坏率逐渐升高,其中当效价为1×106、1×107、1×108PFU/ml时,破坏率为(15.33±2.48)%、(28.61±2.55)%、(37.37±2.72)%,当效价为1×109PFU/ml时,生物膜破坏最高达为(41.73±2.61)%,效价为1×1010PFU/ml时〔(35.33±2.51)%〕呈降低趋势。

3 讨 论

KPN属于革兰阴性杆菌,具有高的侵袭性,是医院获得性感染中最为常见的致病菌,其引起的典型疾病为原发性肺炎、多种肺外感染〔10〕。研究认为〔11〕,抗菌药物大量不合理的使用是造成KPN耐药率、感染率均呈上升趋势的重要原因,特别是KPN耐药菌株的广泛存在,给疾病治疗方面带来很大挑战。本研究结果表明,呼吸道感染、泌尿道感染及血流感染是医院感染的多发部位,提示临床医务工作者需重点关注以上易感染部位,采取预防性的抗感染措施,及时控制医院感染。本文中KPN检出率与以往研究结果存在一定程度差异,可能与不同医院和地区对头孢菌素的数量、种类及时间使用的不同对 ESBLs的筛选、诱导差异有关〔12,13〕。产ESBLs KPN的分离率出现了上升趋势,其中不合理使用广谱抗菌药是最为直接的因素,亦说明合理使用广谱抗菌药的必要性。同时,进一步分析发现,产ESBLs菌、非产ESBLs菌对氯霉素、阿莫西林、庆大霉素的耐药率比较高,而对亚胺培南、美罗培南的耐药率比较低(不超过2%),非产ESBLs对主要抗生素的耐药率均低于产ESBLs。KPN产ESBLs是导致β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制,故而产ESBLs的耐药率明显高于非产ESBLs。同时,因为多数ESBLs基因由质粒所介导,而质粒携带了AmpC 酶喹诺酮类药物、氨基糖苷钝化酶等耐药基因,从而造成多重耐药的产生〔14〕。

近年来,噬菌体疗法已成为抗菌药物以外的另一种抗感染治疗方案,且随着噬菌体技术不断发展,已被广泛应用于多种病原菌感染性疾病。同时,噬菌体于自然界广泛存在,具有分离筛选简单快速、数量多的特点,且噬菌体通过裂解细菌而杀灭病原菌的效果,可对耐药菌株产生良好的杀菌作用。本研究发现,PDR-KPN噬菌斑在双层平板上呈圆形、透亮,大小较为均一,直径约为1.6 mm。其中,噬菌斑的透明度越高、体积越大,则代表噬菌体对宿主菌的杀伤力越强;且既往研究发现〔15〕,噬菌斑随着时间延长而扩大,说明噬菌体可持续性杀伤宿主菌。噬菌体感染宿主具有严格的特异性,并不会干扰其他菌群,从而可避免菌群的二重感染、失调。目前,已有相关研究显示噬菌体可能会对肠道的共生微生物产生影响〔16〕,临床上需要明确噬菌体疗法的疗效,从而为临床方案的制定提供指导。

KPN可形成生物膜,从而在患者感染组织及医疗器械上构成一道物理屏障,进而抵抗消毒剂、抗菌药物的杀灭,使其比游离KPN对抗菌药物更加耐受,增加了院内传播风险。KPN的生物膜形成存在循环往复的特点,在临床上会表现出静止期和急性期交替反复感染的情况〔17〕。本研究结果表明,噬菌体可有效抑制宿主菌生物膜的影响,且基本不受噬菌体感染复数的影响。既往研究发现〔18〕,该抑制效能为时间依赖性,即作用时间越长则抑制率越高,在临床抗菌治疗中可采取抗菌药物与噬菌体的联用,完全杀灭感染细菌。对于已形成生物膜的KPN,随着噬菌体效价的升高,生物膜破坏率逐渐升高,表明在一定范围内破坏生物膜能力随着效价的升高而增强,随后进一步增加效价反而存在降低趋势。尽管既往研究也发现噬菌体的抗菌作用,噬菌体KPN噬菌体B5055与钴离子联用使用时,对生物膜的破坏能力更强,噬菌体与抗菌药物联用使用时,可有效杀灭病原菌,保留感染患肢〔19,20〕,但目前对于抑制、破坏生物膜的作用机制尚不明确,因此仍需通过分子、细胞生物学水平的研究进行深入探讨。

综上,2019～2022年ESBLs检出率总体呈上升趋势,对非β-内酰胺类抗菌药具有较高耐药性,对碳青霉烯类抗菌药物具有较高敏感性。PDR-KPN噬菌体可破坏宿主菌的生物膜及抑制宿主菌生物膜的形成。