孙秀娟, 徐伟慧, 王志刚

(齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院,黑龙江 齐齐哈尔161006)

大豆(Glycinemax)是主要的油料和高蛋白质农作物,种植面积和用途非常广泛,它的营养价值高,在国家粮食战略安全和农产品国际贸易中占有重要地位[1]。为保证大豆产量,采取的主要措施是大量施用化肥[2]。过度使用化肥会导致化肥利用率降低和土壤状态恶化、作物减产、环境污染等问题[3],这迫使人们寻找一种高效的、绿色的施肥方法。

内生菌(endophyte)的概念是由德国科学家、植物病理学之父De Bary于1886年提出,其认为凡是在植物体内的微生物均为内生菌[4]。随着研究者们对植物内生细菌的不断深入研究,发现内生细菌能与宿主植物形成长期相互依存、相互促进的共生关系,通过产生植物激素类物质直接促进宿主植物的生长,如产生吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GAs)等,因此,内生细菌在农业、医药、食品等方面具有重要的应用价值[5]。植物与多种促进植物生长的内生微生物共同生活。根瘤菌与豆科植物建立共生关系,最终形成共生体根瘤,除了结瘤细菌外,根瘤中还定居着许多与根瘤菌不同的细菌,单独接种植物多数不会结瘤,称为非结瘤细菌[6-8]。根瘤内生细菌进入根瘤的途径很多,可以通过根、茎和叶等组织或器官进入植物体内,在宿主体内移动,对植物有广泛的生物学作用[9]。钟宇舟等[10]研究表明,大豆根瘤内生细菌DA16-5对大豆表现出较好的促生效果。赵龙飞等[11]从大豆根瘤内分离出的溶磷菌株对大豆生长有促进作用。尽管人们对内生细菌及其在可持续农业中用作生物肥料的研究越来越感兴趣,但与植物其他组织内生菌相比,大豆根瘤内生菌的研究甚少。因此,本研究通过分离和鉴定大豆根瘤内生细菌,研究其植物激素分泌情况和对大豆的促生效果,旨在为大豆专化型微生物肥料开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 大豆根瘤采集

大豆样地位于黑龙江省齐齐哈尔市黑土区。将大豆根系轻轻从土壤中分离出来,取附着在10株大豆根系的根瘤,立即包在硫酸纸里,4 ℃储存,备用。

1.2 培养基配方

酵母甘露醇(YMA)培养基(1 L):甘露醇10 g,酵母浸粉1 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.2 g,NaCl 0.1 g,琼脂20.0 g,pH值6.8～7.0;液体培养基不加琼脂[12]。

牛肉膏蛋白胨(NB)培养基(1 L):琼脂20 g,牛肉膏5 g,NaCl 8 g,蛋白胨10 g,pH值7.0;液体培养基不加琼脂。

铁载体(MKB)培养基(1 L):酪蛋白氨基酸5.0 g,甘油15.0 mL,K2HPO42.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,琼脂20.0 g,pH值7.0;液体培养基不加琼脂。

淀粉培养基(1 L):蛋白胨10 g,NaCl 5 g,牛肉膏5 g,可溶性淀粉2 g,琼脂15～20 g[13]。

油脂培养基(1 L):蛋白胨10 g,NaCl 5 g,牛肉膏5 g,香油或花生油10 g,1.6%中性红水溶液1 mL,琼脂15～20 g,pH值7.2[13]。

蛋白胨水培养基(1 L):蛋白胨10 g,NaCl 5 g,pH值7.6[13]。

糖发酵培养基:蛋白胨水培养基1 L,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1～2 mL,pH值7.6,另配20%乳糖和葡萄糖溶液各10 mL[13]。

1.3 根瘤内生细菌的分离

1.3.1 菌株筛选

挑选个大、饱满、粉红色的10个大豆根瘤置于试管内,用无菌水清洗3次,用质量分数2.5%的HgCl2表面消毒2 min,再用无菌蒸馏水冲洗5次,并用无菌研磨机磨碎根瘤。为确保充分的表面消毒,取最后一次漂洗后的100 μL无菌蒸馏水,涂抹在YMA平板上,28 ℃培养4 d后,没有发现细菌生长。用根瘤浸渍液在YMA培养基上划线,在28 ℃培养4 d,根据菌落大小、形态和颜色分离出不同的菌落,反复划线纯化[12]。

将纯化后的菌株接种于NB液体培养基,30 ℃,120 r·min-1振荡培养过夜,12 000×g离心2 min后保留沉淀,-80 ℃冷藏备用。

1.3.2 溶血试验

将菌株点样接种于血平板培养基,置于30 ℃恒温培养18～24 h后,观察菌落周围有无溶血圈。

1.3.3 16S rDNA菌种鉴定

将保存的细菌于牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化24 h后,取1 mL菌液,12 000×g离心1 min,倒掉上清液,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。选择细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rDNA序列的扩增。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,送至生工生物工程(长春)有限公司测序。获得测序结果后在NCBI数据库中进行序列比对。使用MEGA 5.0软件构建系统进化树。

1.3.4 菌株生理生化特性测定

淀粉水解试验:将灭菌淀粉培养基制成平板,把菌株接种在平板上,37 ℃培养24 h,观察菌株的生长情况,滴入少量卢戈氏碘液,旋转平板,使碘液均匀铺满平板。如菌苔周围出现无色透明圈,说明淀粉已被水解,为阳性,即产生胞外淀粉酶活力。

油脂水解试验:将菌株接种在灭菌油脂培养基所制的固体平板上,37 ℃培养24 h,如出现红色斑点,说明脂肪水解,为阳性反应。

糖发酵试验选乳糖和葡萄糖。将蛋白胨水培养基分装于试管,每管内放1个倒置的德汉氏小管,使充满液体。每管在无菌条件下分别加入20%无菌糖溶液0.5 mL。将菌株接种在试管内,37 ℃培养24～48 h,观察试管颜色变化,以及德汉氏小管中有无气泡,如黄色无气泡和黄色有气泡,为阳性[13]。

1.4 菌株分泌激素和产铁载体能力测定

1.4.1 IAA分泌量测定

采用分析纯IAA制备标准曲线,将200 μg·mL-1的IAA标准液梯度稀释为0、25、50、75、100、125、150和175 μg·mL-1,采用Salkowski显色法测定吸光度(D540)[14]。标准曲线方程为y=0.016 5x+0.009 6,R2=0.998 5。

将冻存的菌株接种到NB液体培养基中,培养24 h制作种子液。按1%的接种量将种子液分别接入含有200 mg·L-1色氨酸的液体NB培养基中,30 ℃,120 r·min-1振荡培养48 h。根据标准曲线计算IAA分泌量。每组3个平行。

1.4.2 铁载体能力测定

吸取1 mL种子液接种于MKB液体培养基中,30 ℃,120 r·min-1振荡培养48 h。将上清液与CAS检测液各3 mL均匀混合,反应1 h,630 nm处测定吸光值(D630s)[15]。对照组为不接菌的MKB液体培养基,测定方法同上(D630r),每组3个平行实验。按照以下公式计算铁载体活性(Y)[15]。

Y=(D630r-D630s)/D630r。

(1)

1.4.3 GAs分泌量测定

将分析纯GAs溶于70%乙醇中,配制成100 μg·mL-1的GAs标准液,梯度稀释为0、10、20、30、40和50 μg·mL-1,取各浓度的GAs溶液0.5 mL,分别与4.5 mL 98%硫酸混匀并定容至20 mL,于412 nm处测定吸光度(D412)。标准曲线方程为y=0.060 5x+0.003,R2=0.994 7。

按1%的接种量将种子液转接NB培养基中,30 ℃,120 r·min-1振荡培养48 h。取0.5 mL上清液测定菌株GAs浓度,以确定各菌株最大GAs分泌量[16],每组3个平行实验。

1.5 植物促生长试验

1.5.1 浸种促生试验

将筛出的根瘤内生细菌发酵液接种于NB液体培养基中,30 ℃,120 r·min-1培养至D600=1,用0.9% NaCl溶液分别稀释10倍、20倍和30倍,以0.9% NaCl溶液为对照。挑选大小一致的大豆种子置于底部铺2～3层滤纸的培养皿中,每个培养皿放6粒大豆种子,每个处理重复3次,共计30颗。置于27 ℃恒温人工气候箱培养,16 h光照、8 h黑暗。观察记录大豆发芽情况,直到连续3 d无新的发芽种子出现,测量根长[17]。

1.5.2 温室条件下的植物接种试验

大豆种子首先用水洗净,放在体积分数75%乙醇中浸泡3 min,再转至0.1%次氯酸钠中浸泡2 min,然后用无菌水冲洗6～10次,将消毒好的种子播种到盛有灭菌蛭石的塑料盆中,3～4 d后种子即发芽[18]。将根瘤内生细菌接种在NB培养基上活化,然后转接在NB液体培养基中,28 ℃,120 r·min-1振荡培养48 h,用无菌0.9% NaCl溶液将菌体浓度调至1×108CFU·mL-1。

将大豆幼苗移栽到蛭石里,并在大豆根附近接种10 mL根瘤内生细菌混悬液,1周浇1次MS营养液和菌液。将植株置于白天25～30 ℃、夜间15～20 ℃、每天光照8 h的温室中培养。培养40 d后收获。以不接种根瘤内生细菌为全空白对照[19],每处理设3次重复。每天随机调换花盆位置。

1.6 数据处理

用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析,并用Duncan法进行多重比较;采用GraphPad Prism 8.0.2软件统计分析相关数据和制图。

2 结果与分析

2.1 根瘤内生菌的筛选与鉴定

从大豆根瘤中共分离到17个菌株,经16S rDNA序列分析,有10株为芽孢杆菌属(Bacillus),3株为巨大普里斯特氏菌属(Priestia),其余4株分别为肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)和农杆菌属(Agrobacterium)(图1)。

图1 基于16S rDNA序列的内生细菌进化树

溶血试验结果显示,有4株细菌的菌落周围产生了溶血圈,判断这4株菌株具有溶血性。通过16S rDNA鉴定最终确定了10株内生细菌,其中芽孢杆菌属5株(编号S1～S5),其余5株菌分别为Priestia属(S6)、Enterobacter属(S7)、Klebsiella属(S8)、Acinetobacter属(S9)和Agrobacterium属(S10)。

10个菌株的生理生化特性如表1所示,S1、S2、S3、S5和S6具有水解淀粉能力,说明5株菌株均产生淀粉酶;S4、S7、S8、S9和S10具有水解油脂能力,说明细胞外存在脂肪酶;S1、S2、S3、S5、S7、S8和S10具有分解乳糖的能力;S1、S2、S3、S4、S7、S8和S9具有分解葡萄糖的能力。

表1 内生细菌的部分生理生化特性

2.2 菌株分泌激素和产铁载体的能力

由图2-A可知,根瘤内生细菌均具有分泌IAA的能力,其中S8分泌量最高,为147.55 mg·L-1;S4、S7和S10也具有较高的IAA分泌量,分别为41.94 mg·L-1、100.02 mg·L-1和60.42 mg·L-1,且经过多次传代后产IAA特性稳定。通过铁载体活性测定筛选出6个菌株产生铁载体;其中,S3的铁载体活性最高,为70.57%;S1、S2、S4、S6和S8的铁载体活性分别为1.89%、51.68%、21.24%、49.71%和4.84%(图2-B)。由图2-C可知,GAs分泌量最高的为S10菌株,达39.34 mg·L-1,其余菌株分泌量在14.38～32.81 mg·L-1。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 植物促生试验

图3-A～图3-E显示,浸种7 d后有5个菌株在稀释30倍时大豆的根最长,分别是S1(5.667 cm)、S2(7.550 cm)、S5(9.675 cm)、S8(8.130 cm)和S10(6.220 cm)。由图3-F、图3-G可知,有2个菌株在稀释20倍时大豆的根最长,分别是S3(6.475 cm)和S9(5.833 cm)。有3个菌株在稀释10倍时大豆的根最长,分别是S4(5.033 cm)、S6(6.933 cm)和S7(7.367 cm)(图3-H、图3-I、图3-J)。综上所述,筛选得到的10个菌株均可以促进大豆幼苗根系发育。

通过盆栽试验,进一步确认植物的生长促进特性,结果如图4所示。接种10个菌株的大豆株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重均显著高于对照组,接种S1、S6和S8的大豆植株株高比对照组分别高32%、19%、24%,接种S5的大豆根长比对照组显著增加39%,接种S3、S9和S10的大豆植株地上部鲜重分别比对照组显著增加98%、81%、86%,接种S2、S4、S7和S10的大豆植株地下部鲜重分别比对照组显著增加130%、157%、126%、151%,接种S1、S3、S4、S5、S9和S10的大豆植株地上部干重分别比对照组显著提高85%、98%、93%、77%、99%和122。除接种S1、S6、S7、S8、S9的大豆幼苗地下部干重与对照无显著差异外,接种其他菌株的大豆地下部干重均显著大于对照组,其中,接种S4的大豆植株地下部干重比对照组显著提高144%。除接种S6、S8菌株的大豆茎粗与对照组差异不显著外,接种其他菌株的大豆茎粗均显著大于对照组,其中,接种S3、S4、S10的大豆植株茎粗与对照相比显著增加28%、31%、30%。综上,如图4-F所示,与对照组相比,加入根瘤内生菌的大豆各项指标都有所提高,说明菌株对大豆具有促生效果。

F,综合能力评价。

3 讨论

根瘤中同时定居着很多与根瘤菌不同的内生菌,其中非共生细菌也生活于根瘤中,但不引起植物病害,即根瘤内生细菌[20]。目前,豆科植物有1 800多种,在豆科植物根瘤中常见的内生细菌有假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、农杆菌属,由于所有这些属的物种在土壤中都很常见,因此,内生细菌可以看成是根际细菌的一个亚种群[21-22]。本研究分离的10株菌包括芽孢杆菌属、巨大普里斯特氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、农杆菌属和不动杆菌属,均不具有溶血性。芽孢杆菌由于其优良的抗菌、对植物种子发芽与根系生长的促进作用,能提高作物产量,已成为中国种植业中使用最普遍抗菌剂之一[23-24]。克雷伯氏菌分布于植株的根部和土壤中,在长期进化和系统发育过程中与植物建立了紧密的合作关系,对植物的生长与代谢起间接促进作用[25]。克雷伯氏菌能够定殖在玉米植株内,为内生固氮菌,对幼苗期玉米具有显著的促生长作用[26],本研究通过溶血试验证明克雷伯氏菌属具生物安全性。

豆科植物根瘤内生菌在体外表现出不同的植物生长促进机制,包括植物激素的产生,如吲哚乙酸、固氮和磷酸盐溶解[27]。本研究获得的所有菌株都能够以色氨酸为前体合成IAA,同时分泌GAs,并且超过一半的菌株能产生铁载体,对大豆植株的生长有不同程度的促进效果。赵晓妍等[28]从大豆叶片中分离得到产IAA的内生菌菌株YDX14,该菌株可以促进小麦幼苗的生长。作为植物生命进程的开始,种子萌发在农业上很重要。用本试验筛选的内生细菌浸种处理大豆种子,可以明显促进大豆根的生长,说明筛选的菌株对大豆幼苗生长有较好的促进效果,但是不同浓度菌液和不同菌种对大豆种子的促生作用效果不同,有的菌液浓度反而抑制种子根的伸长,出现这种情况的原因可能是不同浓度内生细菌的代谢产物量不一样或者不同细菌的生长规律、特性不同,需进一步研究。

内生菌与其宿主植物这种互利共生的关系,是在长期的协同进化过程中形成的,通过内生菌自身代谢产物来促进植物生长[29]。所筛选的10株菌株均对大豆植株的株高、根长、茎粗和地上地下部生物量具有较强的促生作用,可能是与菌株分泌IAA和GAs等有密切关系。有研究表明,芽孢杆菌KC-1和MD12-2具有产生IAA的能力,并且对大豆的株高和生物量有显著促生效果[30],这与本研究结果一致。从大豆中分离出的40株芽孢杆菌中,巨大芽孢杆菌SN10E1能够使豆芽长度提高41%[31]。衡楠楠等[32]将从大豆根瘤中分离的内生菌株SCAUs8接种大豆植株,不仅植株的株高、鲜重等指标显著提高,而且大豆植株产量比不接种也增产了21.4%～29.7%。丁玮[33]用9株泡桐根瘤内生细菌接种泡桐幼苗,结果显示,其中地下生长量平均提高19.7%、苗高生长量平均提高23.4%。Zhang等[34]分离鉴定的1种内生细菌高地芽孢杆菌对不同植物的生长有促进作用。何建清等[35]筛选出的菌株SR10-6能显著促进黑青稞株高、根长等的生长,可作为开发和推广黑青稞专用生物肥料的优良菌种。本研究结果表明,从大豆根瘤中分离到的内生细菌在体外具有植物生长促进特性,是一种很好的微生物肥料候选材料。

综上所述,本文从大豆根瘤中筛选了17株根瘤内生细菌,通过16S rDNA和溶血试验最终确定了10株根瘤内生细菌,它们均产生IAA和GAs,有6株产生铁载体;这10株菌株对大豆的萌发,以及大豆植株的株高、根长等有促进作用。