杨凯 李潇

在现代种植系统中，钛及钛合金由于良好的耐腐蚀性、抗疲劳强度以及较低的弹性模量已被广泛应用于口腔种植修复及重建[1]。此外钛表面还能进行各种处理，如酸蚀喷砂、阳极氧化等；负载表面涂层如功能肽、羟基磷灰石及其他钙磷化合物涂层等可进一步促进种植体的骨结合作用[2]。尽管如此，钛牙种植体的5 年成功率仍然只有90.1%～96.5%[3]。制约种植体成功率无法达到100%的因素不仅有材料性能的限制，时间也是一个重要因素。在新钛表面，生物活性会随着时间的推移而降低，这种与时间相关的生物性能衰退称为钛的时间相关性老化（Time-dependent degradation）[4]。由于种植体从生产到临床植入存在存储运输的时间，那么延缓甚至提升因老化而降低的生物活性是非常有必要的。故本研究围绕可能导致生物老化现象的物理化学性质、预防措施进行综述，希望对理解这种现象并进一步改善种植体表面生物活性提供不一样的角度。

1 钛金属的时间相关性老化

钛的时间相关性老化指钛金属及钛合金表面随着时间的推移，逐渐发生表面物理化学性质的变化，包括亲水性下降、碳氢化合物的吸附、电荷状态的改变等[5，6]，进而导致其生物学性能下降。有研究表明，4 周老化后的钛片表面成骨细胞行为和反应以及早期骨结合强度均下降一半以上[6～8]，而这些细胞行为与反应和老化钛片表面的物理化学性质的改变关系密切。

亲水性作为材料表面的代表标志物，吸引血液为种植体愈合提供营养和氧气，对种植体早期骨形成、稳定性、周围骨再生和软组织愈合都有一定积极作用[9]。许多研究证明，钛表面老化最明显的特征是表面亲水性的下降，刚制备出的钛片表面水接触角（Contact angle，CA）＜5°，而在4 周后往往超过60°[5，6，10]。

细胞粘附水平还跟钛表面碳百分比紧密相关[11]。空气中储存的钛金属表面会不断地从大气、水和清洁溶液中吸附有机杂质，例如碳氢化合物。表面能相对高的新钛表面不仅吸引水分子还容易吸附相对低能的碳氢化合物[12]，从而转变成低能表面并降低亲水性。钛片在空气中储存4 周后碳含量上升至60%左右[7]，而市场上无菌包装的钛种植体表面碳含量为32%～52%[13]。

在4 周老化的钛片表面的蛋白质吸附量相较于新制备表面显著下降[5]。蛋白质可以通过Arg-Gly-Asp（RGD）氨基酸序列选择性识别将细胞吸附在钛表面，进而增加细胞黏附，材料表面电荷状态可以决定蛋白质吸附能力，研究证明老化后的钛表面呈现负电[6]，在生理pH 值下人血清白蛋白也带负电，同性相斥导致白蛋白难以黏附在钛表面。

目前医用植入物的生产、销售和储存还没有公认标准，这种老化现象也没有引起临床医生的足够重视，但时间导致的生物活性衰退是确实存在的，如何预防这种老化现象无疑是一个值得我们重视的问题。

2 表面处理

由于老化现象贯穿种植体生产、储存、运输的整个过程，在不同阶段可以采取不同的预防措施来减小甚至抵消老化带来的生物活性下降。在种植体生产时一般会进行各种表面处理或负载表面涂层，来改善种植体的骨结合作用，同理可通过改性和涂层等方法隔绝空气污染来使种植体保持长期亲水性。

2.1 表面改性在阳极氧化中，非晶锐钛矿不断生成的同时产生中间产物活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），如羟基自由基及亲水性COO-和OH-氧化产物，这有利于保持钛表面亲水性[14]。Shibata 等[15]发现阳极氧化钛片即使在4 周后都有较低的水接触角（＜5°）以及较高水平的细胞黏附和成骨基因表达。

2.2 表面涂层4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）是一种非挥发性的两性离子缓冲剂，主要用于细胞培养试剂和储存生物分子和细胞[16]。Suzuki 等[17]认为HEPES 可以将钛与空气隔绝，免受来自大气的碳氢化合物污染。于是他们将pH 为7.4 的HEPES缓冲液涂覆在钛片表面并在黑暗中存储，发现在3个月后HEPES 涂层钛片表面依然表现为超亲水性，同时表现出与新钛表面相当的体外生物活性和体内骨结合能力。但是HEPES 作为一种化学制剂，尚不清楚在临床植入后对成骨细胞的长期活性是否存在不利影响。

Morra 等[18]发现在种植体表面嫁接亲水性分子也能赋予种植体良好的亲水性，有透明质酸纳米分子层的种植体表面即使在储存1 年后仍能促进种植体表面良好的血液攀附。具有透明质酸的表面纳米层的新型牙科种植体已经过临床检验，证明透明质酸表面分子层种植体与传统商用种植体的临床疗效无明显差别[19]。

3 储存介质

传统商用种植体在生产灭菌后常封装入常温常压的无菌空气包装中，虽然能隔绝微生物的污染，但对避免空气中碳氢化合物的污染无能为力，也无法阻止亲水性的下降，于是可以在储存时通过将空气与钛表面有效隔开以延缓老化的速度。

3.1 真空包装Kamo 等[20]将碱热处理钛片封装入＜50kPa 的铝真空袋中，即使在52 周后钛片仍保持高亲水性（CA＞10°），其表面蛋白质吸附力和磷灰石形成能力也没有受到时间的影响。而Choi 等[21]将紫外线处理15min 的钛片封入＜32kPa 的低真空无菌干燥器中，发现在28 天后钛片表面蛋白质粘附能力依然保持，但细胞粘附与伸展面积等细胞行为和储存在空气中的钛片相比没有明显差异。尽管储存在真空中阻隔空气污染效果十分显著，但亲水性以及残留生物效应相较于水溶液储存更低[21]。

3.2 水溶液储存Ghassemi 等[22]将钛片装入0.9%NaCl 中6 周后发现除了成骨分化性能，其细胞附着能力和伸展面积都没有得到增强。他们认为这与残留在种植体表面的Na 和Cl 元素有关，这些无机元素会影响诸如细胞附着和增殖之类的细胞行为。纯水（dH2O）和生理盐水同为水溶液储存方法，不仅防止大气中碳氢污染以保持亲水性，还排除了其他异质离子如Na+和Cl-的影响。Shen 等[23]发现储存在dH2O 中的钛片要比储存在空气中的钛片保持有更高的细胞附着、增殖能力。Choi 等[24，25]发现dH2O 储存后的钛片表面的细胞附着能力和伸展面积等细胞行为都没有因时间的流逝而有所损失。尽管如此水溶液储存并不能完全防止而只能延缓碳沉积[22]，于是“预防”后还需进一步搭配“清除”才更能有效减少表面碳污染。

4 椅旁处理

临床上一般将种植体从无菌包装中取出后直接植入患者口腔内，而种植体在经过存储运输后的表面性能会有所下降，钛的表面性能存在不同程度衰退，导致钛种植体与骨的结合能力下降，因此，如何简单快捷地在椅旁重新激活钛表面的理化性能及生物活性具有重要的临床意义。

4.1 紫外光照射（Ultraviolet treatment）钛表面进行紫外光照射已被证明可以显著加速并增强钛植入物的骨传导能力[24]，在不改变钛表面形貌的同时与粗糙表面有协同促进成骨作用[25]。回顾性临床研究也证明紫外线处理可以减少早期种植体的失败，在大约2.5 年的功能负荷期间，光功能化种植体的成功率为97.6%[26]。Iwasa 等[27]对黑暗中储存4周后的酸蚀钛片表面进行48h 的照射，发现紫外线处理后钛表面带正电，从而增强蛋白质附着和细胞粘附。Guo 等[28]则发现紫外线处理能够增强人牙髓干细胞在4 周老化钛表面的附着能力和成骨活性。UV 处理与dH2O 储存在对抗老化方面还具有协同效应，Shen 等[23]将dH2O 中储存4 周的钛片进行UV 处理，发现钛片表面由于dH2O 储存而得到增强的生物性能可以通过UV 处理得到进一步提高。

关于处理时间，在1min 到16min 的尺度中，12min 紫外线处理[强度为0.15mW/cm2（λ=253.7nm）]可能是一个比较合适的时间[29]。而另一项研究证明要想恢复表面亲水性和碳氢化合物的去除至少需要紫外线处理15min[3.5mW/cm2（λ=250nm）][30]。处理时间可能会因为设备条件、表面改性以及细胞种类的不同而变化，仍需要规范统一进行后续研究以确定最佳的处理时间。紫外线辐射对高度聚合的化合物没有渗透性，因为它的波长相对较长，即最小为250nm。为了达到紫外线光功能化的目的，临床医生必须从塑料容器中取出植入物并对其进行至少15min 的紫外线照射，但这将面临植入物被污染的风险。

4.2 非热大气压等离子体（Nonthermal atmospheric pressure plasma，NTAPP）等离子体被称为物质的第四态，是气体分子被电场电离而产生的。NTAPP 也称低温大气压等离子体，气体的表观温度通常比传统等离子体低得多，甚至低至室温，使得产生的化学反应可以在椅旁进行。NTAPP 能够将多种官能团连接到材料表面，从而增强表面亲水性以及细胞相容性[31]。Wang 等[28]以及Lei 等[32]使用低温氩氧等离子体处理老化的钛片，处理后的钛片表面呈现更高的亲水性以及更低的碳原子比例，老化钛表面的细胞附着、增殖以及矿化都得到了增强。然而从经济和临床的角度来看可能需要用到更便宜且临床上容易获取的气体，大多数牙椅都有内置的空气压缩机，所以空气是更为理想的选择。Choi 等[24]使用基于空气的NTAPP 对钛片处理10min 并储存28d 后评估其生物性能随时间的变化情况，发现基于空气的NTAPP 处理同样能够增强钛片上的蛋白吸附、成骨细胞附着和骨架发育。有研究证明NTAPP 的最佳处理时间是相对较短的1min[29]，较短的处理时间意味着较低的污染风险，这使得NTAPP 在椅旁处理方面有着巨大的应用潜力。

4.3 伽马（γ）射线（Gamma ray）与紫外线类似，γ 射线能够清除钛表面的有机分子，同时在辐射中会产生自由基并提升亲水性[33]。作为高能射线，γ 射线相比于紫外线以及等离子体最大的优势在于它的高穿透性[34]，即使在密封包装里依然可以穿透种植体产品，不需要破坏种植体密封包装，这有利于保持种植体在植入前的无菌状态。Ueno 等[35]对4 周老化的钛片进行γ 射线处理（30kGy），其表面恢复了亲水性并降低了碳原子含量，对蛋白质和细胞拥有高亲和力并提高了骨结合强度。在剂量选择上，由于医疗器械的γ 射线辐照剂量普遍为25～35kGy，并且在30kGy 和100kGy 剂量下的γ 射线处理后碳原子大致相同，所以选择30kGy 可能是比较合适的辐照剂量[35]。γ 射线在克服生物老化上有其独特的优势，即高穿透性以及同样优秀的生物活性诱导能力。但由于γ 射线对人体有较大损伤，这是将其应用于椅旁即刻处理的最大限制。

5 结语

钛基种植体在制造完成后其表面的生物活性会随着时间逐渐减弱，对于种植术后成功率有一定影响。而其生物活性主要受到亲水性下降、碳氢化合物污染等因素的影响，在种植体生产到临床植入之间采取隔绝或清除污染的预防措施以保持其表面活性：①种植体生产时表面涂敷生物相容性液体或亲水性物质来隔绝大气污染；②运输存储过程中进行碳隔绝性储存如真空包装或纯水存储等；③临床植入前进行椅旁操作如紫外线、等离子体、伽马射线照射等处理。临床上通常是把种植体从无菌包装中取出后直接植入患者口腔内，而不会进行其他的椅旁措施，虽然可以很好地保证无菌植入，但同时也错失了提升种植体生物活性的最后机会。随着椅旁措施的处理时间越来越短，临床医生可以结合患者意愿、全身健康状况、口腔健康习惯以及口腔检查与辅助检查结果等具体情况适当选择椅旁处理方案。