王昱欢，马晓峰，陈颖，永胜，杨惠

1 青海大学医学院，西宁 810016；2 青海省心脑血管病专科医院心血管病一科

青藏高原是世界上面积最大的高原，平均海拔高度约4 900 m，长期居住人口为6 000万～8 000万［1］。随着时代发展，由工作、旅游等原因前往高原短期居住的人口逐年增多，可能表现出高原不适应症［2］。短期旅居者在海拔2 500～3 000 m即可发生身体不适，如持续运动或继续登高，则进一步引发肺组织及脑组织损伤［3］。高海拔低氧环境可诱发肺部损伤，与通气/血流比例失调、化学感受器变化、水通道及蛋白变化、遗传基因易感性等直接相关［4］。从组织细胞的角度考虑，上述因素直接影响了肺组织的平衡稳态，严重者甚至会引起肺组织细胞死亡［5］。当细胞受到缺氧刺激时，肺组织细胞的保护性程序被启动，主要包括细胞自噬及细胞凋亡，通过细胞自噬可加快细胞代谢循环、协助细胞适应环境以促进细胞存活，而通过细胞凋亡能及时主动清除机体衰老及异常的细胞，从而维持内环境的相对稳态［5-6］。尽管细胞自噬与凋亡在代谢途径和形态学方面有着显著区别，但二者之间存在着多层次、多元化的联系，如自噬相关蛋白Beclin-1可与抗凋亡蛋白Bcl-2结合，直接调控细胞凋亡［7］。此外，自噬相关基因Atg-5、Atg-11诱导细胞凋亡的作用可被凋亡因子Bax所抑制［7］。2021年11月—2023年1月，本研究以渭河平原和青藏高原饲养的C57BL/6小鼠为研究对象，探讨高原低氧环境下小鼠肺组织细胞的自噬及凋亡情况，为后续高原低氧暴露诱发肺脏疾病分子机制的相关研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：C57BL/6小鼠30只，8周龄，体质量22～24 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。主要试剂：鼠SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，苏木素、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，全蛋白提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，BCA试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；自噬相关因子Beclin-1、LC3B、p62以及凋亡相关因子Bax、Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，一抗稀释液、二抗稀释液、ECL发光显色试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 动物分组及饲养环境干预方法 将30只C57BL/6小鼠随机分为高原低氧组、对照组，每组15只。高原低氧组饲养于青海省果洛藏族自治州玛多县人民医院（平均海拔约4 226 m），对照组饲养于西安市雁塔区西安交通大学实验动物中心（平均海拔约419 m）。小鼠饲料均为普通标准维持型饲料，饲养温度26～28 ℃，相对湿度40%～60%；给予充足的水和鼠粮供小鼠自由采食、饮水，连续饲养21 d。淘汰咬伤、采食不正常小鼠，每组各取10只采用脊椎脱臼法处死，并迅速采集肺脏组织。

1.3 肺组织自噬体数量观察 使用生理盐水冲洗两组小鼠肺组织，在预冷操作台上，用手术刀片切成长、宽、高约为1 mm的组织块；2.5%戊二醛液固定24 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，1%锇酸固定12 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次；梯度浓度乙醇、丙酮脱水，618环氧树脂浸透包埋，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色。采用透射电子显微镜观察肺组织，每个样本随机选取5个视野，计算每个视野的自噬体数量，取平均值。

1.4 肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白检测 ①采用免疫组化法：取两组小鼠肺组织，10%甲醛溶液固定48 h，自来水过夜冲洗；脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化，微波抗原修复并冷却至室温，3%过氧化氢室温避光孵育15 min，山羊血清室温孵育15 min；以兔抗鼠Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2多克隆抗体为一抗，4 ℃孵育过夜，以健康C57BL/6小鼠血清为一抗空白对照，37 ℃复温45 min；加入生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育15 min，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温孵育15 min；DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片，烤片，光学显微镜镜检。每个样品选取5张切片，每张免疫组化切片中随机选取5个视野（×200），以细胞膜、细胞质及细胞核染成棕黄色定义为阳性。使用Image-Pro Plus6.0软件分析积分光密度值（IOD）并计算面积（Area），以IOD/Area表示阳性信号表达情况。②采用Westen blotting法：取两组小鼠肺组织，按照全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白中加入上样缓冲液变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。将蛋白质转移到PVDF滤膜上封闭，PVDF滤膜浸泡在10% TBST溶液中，置于摇床上洗膜10 min×5次。分别加入兔抗鼠Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2及内参β-actin一抗（1∶ 2 000），4 ℃孵育过夜；10%TBST冲洗10 min×5次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶ 4 000），室温孵育90 min。10% TBST冲洗10 min×5次，加入ECL显色液。凝胶成像分析系统拍照，Image-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值，计算Beclin-1、p62蛋白相对表达量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax。

1.5 肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取两组小鼠肺组织，参照TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，采用核酸蛋白分析仪测定 RNA纯度，利用逆转录试剂盒合成cDNA。参照SYBR Green试剂盒说明书进行PCR检测。以 2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，计算Bax mRNA/Bcl-2 mRNA。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料采用S-W正态性检验，符合正态分布以表示，组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺组织自噬体数量比较 高原低氧组与对照组自噬体数量分别为（4.80 ± 0.84）、（1.80 ±0.45）个，两组比较P＜0.05。见OSID码图1。

2.2 两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白阳性信号表达情况比较 与对照组比较，高原低氧组肺组织Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性信号表达增强，p62、Bax阳性信号表达减弱（P均＜0.05），LC3B阳性信号表达无明显变化（P＞0.05）。见表1及OSID码图2。

表1 两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白阳性信号表达情况比较（）

表1 两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白阳性信号表达情况比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别高原低氧组对照组Bcl-2 0.57 ± 0.06*0.19 ± 0.01 n 10 10 Beclin-1 0.71 ± 0.01*0.42 ± 0.02 LC3B 0.37 ± 0.02 0.37± 0.09 p62 0.21 ± 0.03*0.57 ± 0.03 Bax 0.34 ± 0.04*0.76 ± 0.08

2.3 两组肺组织Beclin-1、p62蛋白相对表达量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax比较 见表2及OSID码图3。

表2 两组肺组织Beclin-1、p62蛋白相对表达量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax比较（）

表2 两组肺组织Beclin-1、p62蛋白相对表达量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别高原低氧组对照组Bcl-2/Bax 1.18 ± 0.14*0.44 ± 0.07 n 10 10 Beclin-1 0.72 ± 0.04*0.40 ± 0.02 p62 0.41 ± 0.05*0.66 ± 0.04 LC3BⅡ/Ⅰ0.57 ± 0.05*0.37 ± 0.05

2.4 两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比较 见表3。

表3 两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相对表达量及Bax-2 mRNA/Bax mRNA比较（）

表3 两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相对表达量及Bax-2 mRNA/Bax mRNA比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别高原低氧组对照组Bcl-2 mRNA/ Bax mRNA 0.59 ± 0.04*0.21 ± 0.05 n 10 10 Beclin-1 mRNA 0.72 ± 0.09*0.29 ± 0.05 LC3B mRNA 0.86 ± 0.12*0.32 ± 0.08 p62 mRNA 0.27 ± 0.08*0.87 ± 0.05

3 讨论

高海拔低氧暴露会导致外界氧气运输到细胞线粒体的氧分压下降，体内血氧饱和度降低，从而引起机体一系列应激反应，甚至可能形成不可逆的脏器损伤，因此缺氧是目前高海拔地区最关注的医疗问题之一［3］。其中，低氧引发的肺损伤是高原疾病中最为普遍的类型之一［4］。因此，进一步研究高原肺损伤的分子机制有助于进行针对性的预防和治疗。截至目前，探讨高原低氧环境下肺组织细胞自噬及凋亡的研究有很多，主要以体外培养细胞和高压氧舱培养动物模型的方式进行研究，针对实验动物进行真实环境的高海拔低氧环境培养的相关文献较少。本研究以渭河平原以及青藏高原饲养的C57BL/6小鼠为研究对象，通过透射电镜观察肺组织自噬体数量，免疫组化法、Western blotting法及PCR法检测自噬及凋亡相关因子表达；结果显示，高原缺氧环境下的C57BL/6小鼠肺组织细胞自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增强。

凋亡与自噬存在着错综复杂的关系，细胞凋亡过程中通常伴随着细胞自噬，甚至自噬可通过负调控凋亡对细胞起到保护作用［7-8］。自噬可通过降解蛋白质、受损细胞器来保护细胞免受凋亡，然而过度自噬则会引起凋亡或自噬性死亡［7，9］。在缺氧条件的诱导下，细胞自噬被激活，将细胞质中的蛋白质、RNA、糖原、破损细胞器等大量降解，实现物质循环利用，维持细胞稳态，以保证细胞本身的代谢需要和细胞器的更新需求［8］。同时，受缺氧程度及个体缺氧耐受能力的影响，为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡产生应答，即细胞凋亡或坏死［9］。

Beclin-1磷酸化后作为PI3K复合物的整体支架，可促进自噬蛋白定位到自噬泡，其增多表示自噬增强。LC3B参与自噬体膜的形成，是自噬标记物。p62 是自噬体与底物之间的适配蛋白，可调节细胞自噬过程。在自噬过程中，LC3BⅡ升高的同时p62降低，这表明自噬流通畅、自噬增强。Bcl-2与Bax共属一个家族，通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡激活物。Bax二聚体增加膜通透性，Bcl-2与Bax形成的异聚体降低膜通透性。Bcl-2升高和Bax降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，Bcl-2/Bax越大表明抗凋亡能力及细胞自噬越强。本研究透射电镜观察结果显示，高原低氧组肺组织平均每视野下自噬体数量较对照组明显增多，肺组织自噬因子LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1表达增加，并且抗凋亡调控相关蛋白Bcl-2/Bax升高。由此结果推测，受高原缺氧刺激的影响，小鼠肺组织细胞为维持内环境稳定，细胞自噬被激活，细胞质中的蛋白质、RNA、糖原、破损细胞器等大量降解，以保证细胞本身的代谢需要和细胞器更新需求。此外，为了维持正常的生长发育及内外环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的抗凋亡程序产生应答。

研究表明，自噬与凋亡之间有着许多共同的信号转导途径，其中一种途径为低氧激活缺氧诱导因子1触发BNIP3，BNIP3破坏Bcl-2/Beclin-1复合体，从而释放游离的Beclin-1，形成VPS34/Beclin-1复合体，最终激活自噬和抗凋亡过程［9-10］。另外一种途径为缺氧应激激活的蛋白激酶C（PKC）激活JNK1，破坏Bcl-2/Beclin-1复合体，最终促进自噬和抗凋亡过程［11］。此外，缺氧造成的能源消耗促使LKB1、CaMKKβ、TAK1引起AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）磷酸化，进一步引起下游TSCI/TSC2磷酸化，导致mTORC1失活，诱导自噬过程［12］。总之，缺氧状态下的自噬及凋亡调控是一个十分复杂的过程，其调控机制亟待进一步研究探讨。

综上所述，高原低氧环境下的小鼠肺组织自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增强。青藏高原特殊的环境因素可能会刺激小鼠产生应激、缺氧等病理生理过程，进而提高其肺组织的自我修复和抗损伤能力。本研究揭示了高原低氧环境对小鼠肺组织自噬及凋亡能力的影响，为高原缺氧环境下的适应性机制研究提供了重要参考依据。本研究的不足之处在于仅采用了小鼠模型进行研究，因此结果未必完全适用于人，且本研究未进一步探究高原低氧环境对生物体其他组织器官的影响。未来可进一步研究高原低氧环境对不同生物的不同组织器官的影响，为开发高原低氧环境下肺损伤的预防和治疗策略提供更多的实验数据与理论支持。