杨丽楠,常乐,李志艳,闫存玲,曾争,冯珍如

(1.太原市第三人民医院检验科,太原030012;2.北京大学第一医院a.检验科,b.感染疾病科,北京100034)

机体乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性表示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染,乙型肝炎病毒表面抗体(hepatitis B surface antibody,HBsAb)的出现表示具备对HBV的免疫力,预示着HBV的清除和HBsAg的消失。然而,临床上存在一小部分慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者,其血清中能够同时检测到HBsAg和HBsAb,即HBsAg和HBsAb双阳性者,为临床诊断和判定CHB患者的疾病状态带来困扰。

CHB患者HBsAg和HBsAb共存机制的既往研究主要集中在HBV S基因突变、不同血清型HBV感染、HBV再活动以及HBsAg/HBsAb免疫复合物的形成[1]。近年来研究发现HBsAg新增N-糖基化突变、HBV准种多样性、宿主遗传基因的突变和免疫组库表达的差异也可能与HBsAg和HBsAb的共存有关。本文旨在综述CHB患者HBsAg和HBsAb双阳共存机制的新近研究。

1 HBsAg新增N-糖基化突变

病毒包膜N-糖基化是一种翻译后修饰,其修饰位点需有一致的氨基酸序列N-X-S/T(N为天冬酰胺,X为脯氨酸以外的任意氨基酸,S为丝氨酸,T为苏氨酸),在病毒的生物合成、稳定性、抗原性和传染性方面发挥重要作用。HBsAg蛋白在分泌过程中需要经过N-糖基化修饰,尤其是sN146位的糖基化修饰,其对HBsAg分泌最为重要,能够帮助HBsAg蛋白正确折叠,增加其稳定性和亲水性,维持其抗原性[2]。

有研究报道显示,HBsAg新增的N-糖基化可导致过度糖基化,掩盖HBsAg抗原表位“a”决定簇,降低中和抗体的结合能力,造成免疫逃逸[3-4]。卢姗姗等[5]研究发现,HBsAg和HBsAb双阳性患者HBsAg新增N-糖基化突变率显著高于HBsAg单阳性患者,体外试验显示HBsAg抗原性降低,与中和抗体HBsAb结合能力下降,造成血清中HBsAg和HBsAb共存。另外,CHB患者HBsAg和HBsAb双阳者,HBV S基因主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)新增的N-糖基化突变可能是肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生的危险预测指标[6]。

2 HBV准种多样性

在HBV复制过程中,由于逆转录酶缺乏校正功能,无法对错配的碱基进行校正,同时HBV的复制能力极强,从而导致HBV基因组高度变异,在HBV感染者体内形成一群基因序列相似但又存在差异的病毒株,称之为准种(quasispecies)[7]。既往研究只从部分HBV基因组的角度来研究HBsAg和HBsAb的共存,难以全面反映HBsAg和HBsAb共存与HBV基因组间的关系。

高通量测序技术可以研究HBV基因组的全长,发现准种特征。Zhou等[8]评估HBsAg和HBsAb双阳实验组和HBsAg单阳对照组的HBV全基因组准种特征,发现双阳实验组HBV准种多样性显著增加,且观察到更多的阳性选择位点、突变和缺失,突变多位于人类白细胞抗原Ⅰ类分子(human leukocyte antigen Ⅰ,HLA Ⅰ)、HLA Ⅱ或B细胞表位,表明积累突变可能为HBV提供逃避宿主免疫攻击的机会。

准种的变异谱在疾病的不同时期具有不同的适应度[9]。Wang等[10]利用二代测序和生物信息学技术,分析HBV基因C型的HBsAg和HBsAb共存患者HBV S区准种特征,发现HBsAg和HBsAb共存患者组与HBsAg单阳组准种特征有显著差异,HBV S区细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位的免疫原性和主要亲水区(main hydrophilic region, MHR)的抗原性均下降,且HBsAg和HBsAb共存的CHB患者与HBV相关HCC患者之间的准种特征也有差异,存在不同的突变位点,如CHB中的I126S和HCC中的I126T。因此,准种特征的差异表达对HBV感染转归有影响。

3 宿主遗传基因的突变

既往CHB患者HBsAg和HBsAb共存的研究主要集中在HBV的因素上。然而,一些报道的病例存在HBsAg序列突变,但血清中没有检测到HBsAb[11];也有一些没有HBsAg突变的病例同时存在HBsAg和HBsAb[4]。这表明HBV突变体可能不是慢性HBV患者发生HBsAg与HBsAb共存的唯一原因。为了探讨HBsAg和HBsAb共存机制的其他因素,有研究团队进行了宿主因素方面的研究。

全基因组关联研究(genome wide association studies,GWAS)可以用来探索遗传基因变异与复杂疾病的关联,识别复杂疾病易感性与抗性相关基因位点。Wang等[12]用GWAS进行两阶段试验,第一阶段全基因测序发现HBsAg和HBsAb共存CHB患者的候选基因,第二阶段进行候选基因特定区域直接测序的验证试验,发现HBsAg和HBsAb共存CHB患者12号染色体存在寡聚核苷酸合成酶3(oligoadenylate synthetases 3,OAS3)基因的罕见变异。

为了进一步揭示宿主其他相关基因与HBsAg和HBsAb共存是否有关,Fan等[13]在前者第一阶段试验的基础上,根据P值选择30个与HBV相关肝病有关的候选基因,扩大HBsAg和HBsAb双阳组和HBsAg-和HBsAb+对照组的验证样本数,通过飞行时间质谱法(time of flight mass spectrometry,TOF)确认遗传基因,发现位于9号染色体的胞质分裂蛋白8(dedxcator of Gytokmesis 8,DOCK8)等位基因(rs506121-T)和碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9,CA9)等位基因(rs2071676-A)在HBsAg和HBsAb共存CHB患者中表达升高。以上研究均表明,宿主遗传基因与CHB患者HBsAg和HBsAb双阳的产生有一定的关系。

4 宿主免疫组库(immune repertoire,IR)表达的差异

IR是T细胞受体(T cell receptor,TCR)和B细胞受体(B cell receptor,BCR)(也称为免疫球蛋白,Ig)的总和,构成机体的适应性免疫系统[14]。

TCR是T细胞特异性识别和结合抗原肽-主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)复合物的分子结构,大多数TCR由α和β肽链组成,少数T细胞的TCR由γ和δ肽链组成。每条肽链又可分为可变区(V 区)、恒定区(C 区)、跨膜区和胞质区等几部分。而α和β 2条肽链的V 区(Vα、Vβ)又各有3个高变区CDR1、CDR2、CDR3,其中以CDR3变异最大,直接决定了TCR的抗原结合特异性。TCR的CDR3由V、D、J 3个基因编码,在淋巴细胞的成熟过程中,通过V、D、J 基因的随机选择和重组,连接区多样性和α/β或γ/δ链配对形成了TCR的多样性[15-17]。

BCR是一种Y型蛋白,由2条相同的大重链(IGH)和2条相同的小轻链κ(IGK)或λ(IGL)组成。重链可变区由V、D和J基因家族编码,轻链可变区由V和J基因家族编码[18]。在B细胞发育和成熟过程中,V(D)J基因片段的随机重组是由几个酶样重组激活基因(RAG1/RAG2)介导,V-D和D-J(轻链的V-J)连接区域的随机插入或删除有助于BCR的多样性[19-20]。抗原刺激后,会引起体细胞的高频突变,主要是在编码V区CDR部位的基因序列发生碱基的点突变。除此之外,基因转录和重链/轻链配对也提高了BCR的多样性[14]。

免疫组库测序(immune repertoire sequencing,IRS)可以用来探索宿主免疫系统抵御HBV感染的遗传反应和免疫特征。常乐等[21]研究HBsAg和HBsAb共存CHB患者TCR β链CDR3免疫组库,发现V基因型TRBV5-8的表达低于HBsAg-和HBsAb+对照组,V基因型TRBV28低于HBsAg+和HBsAb-对照组;进一步在克隆层面分析发现,克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1在共存组的表达高于HBsAg-和HBsAb+对照组,而克隆型TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7的表达低于HBsAb-和HBsAb+对照组,说明机体免疫系统表达的差异与HBsAg和HBsAb双阳模式存在一定的关联。

随后,Zhan等[22]扩大HBsAg+和HBsAb+双阳实验组和HBsAg-和HBsAb+以及HBsAg+和HBsAb-对照组入组标本数,分析HBsAg和HBsAb共存CHB患者的TCR β链和BCR免疫组库表达情况,发现一些V、D和J基因型如IGHV3-64、IGHV3-75、TRBV5-4、TRBV12-5、TRAV14DV4、IGHD3-16、IGHD6-13和IGHJ3,对应表达这些基因型的细胞,尤其是B淋巴细胞,在HBsAg和HBsAb共存患者中扩展程度不同。用序列预测工具发现“CASSLG”基序在HBsAg和HBsAb双阳患者实验组中表达量增加,“GAGPLT”基序只在HBsAg-和HBsAb+健康对照组出现,其可能与HBsAb中和抗体的产生有关。这些研究可能为HBV疫苗的研发和CHB的治疗提供重要参考价值。

5 预后与管理

CHB患者HBsAg和HBsAb共存现象在临床上越来越多见,且这种双阳模式的CHB较易发展为进展期肝病,如肝纤维化、肝硬化和HCC[23-24]。另外,这一情况增加了患者的治疗难度,其治愈率也较低[25]。因此,临床医生遇到CHB患者血清中同时出现HBsAg和HBsAb时,对这种双阳模式的患者要多关注并定期复查,并结合其他检测指标(如生物化学指标、HBV DNA检测和影像学检查等)来评估和判断患者的临床状态,据此调整患者的治疗方案。实验室工作人员发现HBsAg和HBsAb检测结果同时阳性时,应进行审核分析。首先要排除标本和检测程序的问题,通过复测、留样再测及动态监测等过程,准确发送检验报告。在这个过程中,及时与临床沟通。总之,对于此类患者,要加强跟踪随访,密切关注不良肝脏相关疾病的发生。