程世纪, 匡天瑞, 董可帅, 余 佳

武汉大学人民医院肝胆外科, 武汉 430060

原发性肝癌位于我国恶性肿瘤发生率的第4 位,肿瘤致死病因的第3位[1]。近年来,以免疫细胞为基础的治疗方案在延长肝癌患者生存期、降低癌症转移和复发等方面取得显著成果。自然杀伤细胞(NK细胞)作为肝内主要的淋巴细胞,被认为是抵御肝癌的第一道防线。研究[2]表明,肝癌进展过程中存在NK细胞耗竭,而NK细胞的数量与患者生存率呈正相关,因此恢复NK细胞在肝内的数量和功能,或是一种有效的治疗方法。本文综述了NK细胞的生物学特性、肝癌中的NK细胞及基于NK细胞的免疫治疗在肝癌中的研究进展。

1 NK细胞的生物学特性

NK 细胞是骨髓来源的大颗粒淋巴细胞,占外周血淋巴细胞总数的 10%～15%,在人体先天性免疫和适应性免疫中均发挥着重要作用。生理状态下,NK细胞占肝内淋巴细胞数量的30%～50%,其中80%属于肝内常驻NK细胞,说明NK细胞在肝脏中可能发挥着更重要的作用。人体NK细胞被分为两个亚群,即CD56brightCD16dim和CD56dimCD16bright的NK细胞,前者主要分泌细胞因子,后者则表现出更强的细胞毒性以及抗体依赖的细胞毒作用。NK细胞被认为是抵御肿瘤的第一道防线,具有无需预先致敏、无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制性等属性[3]。NK细胞可通过穿孔素和颗粒酶的细胞毒作用、抗体依赖的细胞毒作用、分泌炎症因子以及对外界细胞因子做出反应等发挥作用。此外,研究[4]表明,肝内常驻的CD49a+NK细胞具有记忆细胞的特点,即在反复刺激下,该细胞可以迅速激活并产生大量IFN-γ。NK细胞的功能取决于胞膜上激活受体和抑制受体与靶细胞相互作用,这些受体与特定的配体结合产生激活或抑制NK细胞的效应[5]。肝内最主要的抑制性配体是在正常肝细胞上表达的MHC-Ⅰ类分子,其可通过与NK细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白受体(killer cell immunoglobin-like receptor, KIR)结合,从而避免损伤正常细胞[6]。而肿瘤细胞等下调MHC-Ⅰ类分子从而躲避CD8+T淋巴细胞的杀伤,此时NK细胞因抑制信号缺失而被激活从而介导肿瘤杀伤。

2 肝癌中的NK细胞

NK细胞对肝癌的监测至关重要,然而肝癌进展过程中,尽管存在异常肝细胞MHC-Ⅰ类分子下调和NK细胞激活,肝内CD56dimCD16bright的NK细胞数量仍急剧减少,且肿瘤浸润区域显著少于正常区域并显示出功能受损[7]。多种因素可导致NK细胞耗竭,其中肿瘤微环境(tumor micro environment, TME)不可或缺。TME指由周围血管、免疫细胞、细胞外基质等构成,肿瘤发生、生长和转移所处的环境。在肿瘤生长早期,肿瘤细胞招募和激活免疫细胞及相关基质成分形成抑瘤性炎性微环境从而阻碍肿瘤进展,而TME能够改变局部趋化环境,优先招募细胞毒性较小的NK细胞。经过持续的抗原刺激,TME中的NK细胞逐渐耗竭而无法正常发挥作用[8]。TME中的缺氧环境、髓源性抑制细胞、吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素E2以及TGF-β等共同构成抑制性免疫微环境,进而导致NK细胞功能受抑。同时肿瘤招募的单核/巨噬细胞可通过CD48/2B4诱导NK细胞快速活化,这些NK细胞随后疲惫并凋亡[9]。此外,肿瘤细胞可上调表面检查点及形成可溶性激活配体从而逃避免疫杀伤[10]。通过这些方式,NK细胞抗肿瘤作用被削弱,最终导致肿瘤逃逸。研究[2]表明,外周血和肝内NK细胞绝对数量与肝癌患者的生存率及预后呈正相关,因此改善患者NK细胞的活性和数量或可有效地杀死肿瘤细胞,实现治疗目的。

3 基于NK细胞的免疫治疗

3.1 抗体相关疗法

3.1.1 免疫检查点抑制剂(ICI) ICI是用于阻断免疫细胞与肿瘤细胞间的免疫检查点,从而解除肿瘤抑制作用的单抗类药物。ICI可通过多种方式影响NK细胞的功能,包括阻断抑制信号、诱导NK细胞表型转化和通过影响T淋巴细胞及Treg细胞活性间接逆转NK细胞耗竭等。NK细胞表面的非MHC-Ⅰ特异性抑制受体如PD-1、 TIM-3、TIGIT、CD96 等被认为是经典免疫检查点,在肿瘤浸润的NK细胞表面不同程度的上调。其中基于PD-1的研究最为广泛。表达PD-1的 NK细胞显示出毒性受损及增殖能力降低等特点,而PD-1的阻断可逆转这些不利影响[11]。临床研究中,PD-1抑制剂纳武利尤单抗治疗肝癌的安全性和有效性得到证实[12],但这并非由NK细胞主导。一项研究[13]将PD-1抑制剂与NK细胞输注联用,在非小细胞肺癌患者中实现了有效抗肿瘤活性,且疗效优于单独输注NK细胞,阐明了PD-1阻断在基于NK细胞的免疫治疗的潜力。然而随着药物的应用,PD-1拮抗剂的耐药性逐渐显现。相关研究[14]表明TIM-3的上调与PD-1阻断的耐药性相关。肝癌患者NK细胞表达高水平的TIM-3,在与其配体半乳糖凝集素-9(Galectin 9, GAL-9)结合早期阶段促进NK细胞成熟。然而TIM-3的持续高表达可中断PI3K/mTORC1/p-S6信号从而导致NK细胞功能障碍[15]。TIM-3单独阻断或与PD-1阻断相结合已展示出充分的治疗潜力。

TIGIT和CD96是同一免疫球蛋白超家族的免疫检查点,主要负责转导抑制信号,在肿瘤浸润的NK细胞上调。两者作为抑制受体与激活受体DNAM-1竞争结合 CD155 ,且亲和力高于DNAM-1[16],因而表现出对NK细胞的抑制作用。CD155在健康人群中几乎不出现,而在各类恶性肿瘤中显著表达,与TIGIT和CD96的结合可抑制NK细胞的毒性和IFN-γ的产生[17]。Sun等[18]证实阻断TIGIT可增加外周血NK细胞对体外培养肝癌细胞的毒性,这表明靶向阻断TIGIT或是恢复肝癌患者NK细胞功能的有效方法。此外TIGIT通常与PD-1共表达,两者的联合阻断可以更有效地逆转NK细胞耗竭。临床研究[19]中,TIGIT抗体维博利单抗被证明具有良好的耐受性,与PD-1抗体联合使用,在晚期肺癌患者中实现抗肿瘤活性。表达CD96的NK细胞与肝细胞癌(HCC)患者预后不良相关[18],体外研究[20]表明CD96的阻断可促进NK细胞IFN-γ的释放和增强抗肿瘤应答,但尚缺乏临床证据支持。

NK细胞表面MHC-Ⅰ特异性抑制受体如KIR、NKG2A等亦是NK细胞群的典型免疫检查点,与经典免疫检查点在激活的NK细胞中上调不同,KIR、NKG2A等在实体肿瘤浸润的NK细胞中稳定表达[21],介导NK细胞免疫耐受的作用不可或缺。然而研究[22]表明,KIR抑制剂及NKG2A抑制剂单药疗效有限,提示研究重点或是联合治疗方案。

3.1.2 MICA/B特异性抗体 MHC-Ⅰ类相关蛋白MICA和MICB是构成NK细胞的激活配体NKG2DL结构的一部分。正常情况下,NKG2DL仅在肿瘤组织中表达[23],并与NKG2D结合,介导机体抗肿瘤反应。然而肿瘤细胞据此产生多种逃逸机制,其中最常见的是膜结合NKG2DL脱落成为可溶性配体,后者可下调NK细胞表面NKG2D的表达,从而逃避NK细胞攻击[24]。Ferrari等[25]据此设计了MICA/B特异性抗体7C6,该抗体掩盖了MICA/B的α3结构域,减少癌细胞丢失细胞表面的NKG2DL并增强NK细胞的细胞毒性。Oliviero等[24]将该抗体用于肝内胆管癌患者,结果表明7C6的加入显著促进了外周血及肿瘤浸润区域NK细胞脱颗粒和IFN-γ的产生,为MICA/B抗体的使用提供了证据支持。

3.1.3 双特异性抗体(BsAb)与双特异性杀伤细胞接合剂(BiKE) BsAb是含有2种抗原结合位点的人工抗体,其中一个识别肿瘤抗原,另一个与NK细胞上CD16结合。由于CD16有不同的亚型,各亚型与抗体的亲和力不同,NK细胞表现出不同的杀伤活性。BsAb中抗CD16成分可通过与CD16更强的相互作用来抵消这些差异并改善NK功能[26]。而与完整的BsAb不同,BiKE仅由两个相互连接的可变片段组成。与其他类型的抗体相比,BiKE能够更自由地对抗体片段进行组合,且得益于其小分子特性,BiKE具有更好的实体肿瘤穿透性[27]。综上所述,BsAb和BiKE将肿瘤抗原与NK细胞连接起来,促进两者形成免疫突触,使NK细胞能够特异性地、更加有效地发挥抗体依赖的细胞毒作用。除了BsAb和BiKE,多特异性抗体和多特异性杀伤细胞接合剂能为抗原结合提供更多选择、更加有效地招募免疫细胞,亦值得探索。

3.2 过继性细胞疗法

3.2.1 自体或同种异体NK细胞移植 自体NK细胞输注因治疗风险低且无后期免疫抑制的需要而最先受到关注。然而输注的细胞虽然能够在体内扩增,但因输注前采集和预处理对NK细胞功能的影响以及MHC-Ⅰ类分子的抑制作用,过继的NK细胞无法对肿瘤产生有效作用,同种异体NK细胞成为新选择。同种异体NK细胞表面KIR与宿主细胞的MHC-Ⅰ不匹配,因而可以被激活。然而由于原代NK细胞的分离和纯化存在困难,NK-92细胞系、脐带血(umbilical cord blood, UCB)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)来源的NK细胞逐渐受到关注。目前应用最广泛的是来源于非霍奇金淋巴瘤患者外周血的克隆细胞系NK-92。NK-92属CD56brightCD16dim的NK细胞,可高表达穿孔素和颗粒酶B,具有高度的细胞毒性[28]。NK-92表达许多激活受体,包括NKG2D、NKp30、NKp46和2B4,而缺乏除KIR2DL4和CD94/NKG2A以外的大多数抑制受体,使得NK-92细胞的激活得到保障[29]。在良好操作规范条件下,NK-92细胞可大量扩增使其成为过继细胞的良好选择。临床研究[30]表明,NK-92细胞用于过继细胞治疗是安全的,在晚期癌症实验中没有出现严重的不良反应并在各类肿瘤模型中显示出治疗潜力。然而NK-92在体内扩增困难,且由于输注前γ射线照射导致其持久性不足等问题使其无法发挥最大疗效。宿主体内的单个核细胞可靶向裂解NK-92细胞,进一步降低了其在体内的存活率,部分研究[31]表明与IL-15共同给药似乎能缓解这种排斥反应。此外NK-92细胞高度依赖IL-2,而IL-2的重复注射会带来诸多不良反应。NK-92细胞的变体NK-92MI和NK-92CI细胞,通过基因改造使其表达hIL-2cDNA以合成内源性IL-2或是一种有效方法。目前,如何保证NK-92细胞在体内的持久性和功能性是该疗法应用的关键问题。

3.2.2 嵌合抗原受体NK (CAR-NK)细胞 CAR-NK细胞是指将含有抗原识别结构域及激活信号的基因引入NK细胞并表达,使其能与特定肿瘤抗原结合而被激活的治疗方法。随着CAR-T淋巴细胞在治疗上取得一定成果,其局限性如MHC限制性、移植物抗宿主反应、脱靶效应、神经毒性和细胞因子释放综合征等随之显现[32]。NK细胞无需预先致敏、无MHC限制等特性,使得CAR-NK细胞可潜在地克服CAR-T淋巴细胞现有的不足,成为过继治疗的新选择。此外多项临床试验[33]表明,NK细胞比基于T淋巴细胞的疗法具有更安全的特征。基于CAR的候选靶标包括:磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3, GPC3)、NKG2D、AFP、上皮细胞黏附分子、细胞间质上皮转换因子、CD147等。其中GPC3是一种在正常肝脏细胞不表达,而在肝癌组织过度表达的糖蛋白。Yu等[34]开发了GPC3-CAR-NK-92细胞并证明其可有效杀伤肝癌细胞。Zhao等[35]在此基础上对CAR进行优化,开发出包含CD8α铰链区域和4-1BB跨膜结构域的GPC3-O4-CAR,后者可以在NK细胞表面高效、稳定地表达,且具有该结构的NK细胞表现出更强的细胞毒性并可以分泌更多IFN-γ。Tseng等[36]以CD147为靶抗原,开发了用于治疗HCC的CD147-CAR-NK细胞并证实该细胞可有效杀死多种肝癌细胞系和抑制PDX小鼠模型中肝癌的进展。该研究在此基础上进一步探索了GPC3-synNotch诱导的CD147-CAR-NK细胞来减轻肿瘤外毒性,此时的NK细胞仅对高表达GPC3的肝癌细胞表现出杀伤活性。

除了引入CAR,从过继细胞中去除负调节因子亦是基因改造的一种选择。由CISH基因编码的细胞因子诱导的SH2蛋白(cytokine-inducible SH2-containing protein, CIS)是NK细胞内IL-15信号传导的关键负调节因子。通过去除NK细胞中的CIS进行代谢重编程,可提高其在体内的持久性和抗瘤活性,增加由IL-15介导的JAK-STAT通路信号传导活性,进而刺激NK细胞增殖[37]。CD38也被认为是NK细胞的负调节因子,表达CD38的NK细胞持久性降低并易受到氧化应激的影响。通过敲除NK细胞中的CD38相关基因,与CD38抗体协同作用,可改善多发性骨髓瘤患者体内NK细胞的持久性并增强抗体依赖的细胞毒作用[38],为增强NK细胞活性提供另一种选择。

然而,该疗法尚面临未解决的难题,其中最主要的便是NK细胞的扩增困难和体内持久性不足。可用于表达CAR的NK细胞有多种来源,其中iPSC来源的细胞有望解决这一问题。iPSC指由数个重编程基因导入体细胞并逐步诱导获得的,具备无限增殖和多向分化能力的人造胚胎干细胞。iPSC可进行精确的基因修饰,有效地分化以产生成熟的NK细胞即iPSC-NK细胞。与其他来源的NK细胞相比,iPSC-NK细胞更易以可靠的方式进行基因改造,且具有更强的抗癌活性,是基因工程细胞的合适来源[30]。目前已有iPSC-NK细胞用于临床试验,包括与ICI联合治疗难治性实体瘤以及对CD16高亲和力的iPSC-NK细胞,有望为iPSC-NK细胞的临床应用提供证据支持。此外,该疗法应用的另一障碍是缺乏合适的引入CAR的载体。最近的研究对离体扩增的人NK细胞慢病毒转导系统性改进后,转导效率为26%～61%[39],或是产生大量基因修饰NK细胞的有效方法。

3.3 细胞因子 正常肝脏中富含的细胞因子对NK细胞的成熟和活化至关重要,其中IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ表现出对NK细胞的促进和激活作用,而其他细胞因子如IL-6、IL-10、TGF-β则直接或间接抑制NK细胞。在有积极作用的细胞因子中,具有调节免疫系统、促进免疫细胞生长、分化等作用的IL-15最受关注。肝癌进展过程中,细胞因子的产生存在免疫规避性抗炎反应,表现为肝内抗炎因子IL-10和TGF-β表达的上调,进而导致各类免疫细胞功能受抑[40]。研究[41]表明,IL-15可增强暴露于肝癌后NK细胞的功能,提示了IL-15的治疗潜力。而与其他细胞因子相比,IL-15更具有维持NK细胞持久性、恢复线粒体完整性、减少细胞凋亡等功能及更低的毒副作用[42]。目前已经设计了几种重组形式的IL-15,如hetIL-15、IL-15“超级激动”剂N-803等,并在临床前研究中取得良好效果。然而IL-15长期使用已被证实可通过表观遗传重编程机制导致细胞周期停滞、活力和溶解活性降低等不利影响[43]。IL-2、IL-21对NK细胞亦有积极作用,其中IL-2因其毒性作用导致应用受限。值得关注的是IL-21可以激活STAT1和PI3K-AKT-Foxo1通路从而逆转TIM-3和PD-1介导的NK细胞耗竭,与其他细胞因子如IL-15的组合可增加NK细胞增殖和IFN-γ的产生[44],提示细胞因子的组合或将取得更佳疗效,同时细胞因子联合其他疗法比单独应用获益更多。

4 总结

随着人们对NK细胞研究的深入,以及免疫学、基因工程技术等发展,NK细胞作为肿瘤治疗主力军成为可能。同基于T淋巴细胞的治疗相比,NK细胞在功能性、安全性等方面显示出优势。相关研究表明,基于NK细胞的治疗取得可喜成果,但也必须正视这些治疗方法带来的挑战,进一步探索兼顾安全性和有效性的治疗方法。目前,尽管该疗法尚处在起步阶段,但仍应坚信基于或联合NK细胞的治疗能在未来肝癌治疗中占据一席之地。

利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明:程世纪负责查找文献,撰写文章;匡天瑞、董可帅负责修改文章;余佳负责指导撰写文章并最后定稿。