张 静 刘苗苗 唐倩倩 尹玉涛 陈 桢 谢忠忱 常 在

(1.清华大学生命科学学院,北京 100084)(2.清华大学实验动物中心,北京 100084)

实验动物设施作为生命科学研究不可或缺的支撑条件,其平台建设和技术服务水平直接影响着相关学科的发展,是实现科技进步,提高我国国际地位的重要基础。清华大学实验动物中心是清华大学“十一五”期间重点建设的校级平台,拥有一期和二期两个实验动物设施,总建筑面积合计7 800 m2,可容纳4万余笼小鼠,少量大鼠、兔、豚鼠、雪貂的饲养和实验。为了给生命相关学科的研究提供优质的实验动物资源和一流的技术服务,我们的工作重心在于建立并维护良好的实验动物保障体系,提升专业技术服务能力,力求对标国际一流水准,为国内实验动物行业发展提供新思路。

1 实验动物质量保障体系的建立

1.1 实验动物福利伦理审查委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的建立及其作用

清华大学IACUC自2010年成立,核心成员包括10名教授、1名主治兽医、1名非生物医学相关研究背景机构成员、1名公众代表(非机构内成员)以及两名秘书。IACUC会议按照团队工作方式定期召开,通过对实验动物的使用计划、操作程序和设施运行进行讨论,形成统一的决议和伦理审查报告,以保证实验动物设施在运行实践中符合相关的法律和法规要求。IACUC具体工作包括:

1.1.1实验动物从业人员资格审查及培训:根据中华人民共和国和北京市有关法律、法规,《清华大学实验动物管理办法》以及《清华大学实验动物福利伦理审查办法》等文件的规定,要求从事实验动物饲养、管理或动物实验研究等相关工作的人员必须持有《实验动物从业人员岗位证书》(以下简称上岗证)。为了满足清华大学新增动物实验人员的需求,以及每5年需要更新上岗资质的要求,清华大学实验动物中心每学期会联合北京实验动物行业协会,对校内有需求的从业人员进行培训并组织资格考试。对于未能参加上岗证考试,但急需开展动物实验的人员,中心提出三点要求:一是实验者需要有经IACUC审批通过的有效实验动物研究及使用计划(Animal Protocol,以下简称AP);二是需在开展动物实验前完成动物中心组织的动物实验操作及屏障使用等培训,取得动物中心屏障设施门禁卡权限;三是在获得上岗证之前,实验者不能独自开展动物实验,需在已考取上岗证的实验者带领下进行动物辅助操作实验。

清华大学实验动物中心为本校师生提供具有针对性的实验动物相关培训,以帮助他们能够快速掌握实验操作技能,实验者可通过实验动物中心的网站预约培训,培训包括基本的屏障设施使用理论及实操培训(每周至少一次)、常规基础实验技术系列培训(每两周一次)、一对一的特殊手术技能培训(根据预约情况决定)、ABSL-2实验相关的理论及实操培训(每两周一次)以及测试相关仪器上机培训(根据预约情况决定)。据后台数据统计,每年培训已达1 200人次以上,极大的为校内师生动物实验的开展提供了便利。

1.1.2AP的审查及更新检查:AP是科研工作者开展动物实验之前必须准备的重要文件,内容包括使用实验动物的原因、需要对实验动物进行的操作,以及为保障实验动物福利采取的有效措施。IACUC的主要职能工作之一是对AP的审查,通过权衡动物实验设计的科学性与实验动物福利间的平衡,分析动物实验涉及的生物安全风险,从而提出适当的安全防护建议及整改方案。一份新的AP从提交、审阅、修改到最终批准,大约需要两周时间。

自2020年春季学期开始,本中心不断增强所提供的服务与AP之间的关联,从开通门禁卡、参加动物中心各项培训到订购实验动物、申请麻醉剂、申请《实验动物福利伦理审查证明》等均需在有效的AP指导下进行。IACUC对实验者提交的各项服务预约申请进行AP有效性审查,对于无效AP会督促实验室提交重大变更申请或后续调整申请。清华大学实验动物中心IACUC在2021年度共审阅并批准AP 125份,审阅已获批实验计划的延期及变更申请69份,后续调整申请206份。

1.2 实验动物供应商的选择和质量保障

清华大学科研工作者对实验动物的种类、品系要求多样,除了使用动物中心常规饲养繁育的3万多笼动物以外,每年仍需要从其他机构购买约15万只实验动物,包括大鼠、小鼠、兔子等,因而,对实验动物供应商的质量评估也纳入了本中心兽医的工作范围。作为实验动物质量保障的重要环节,中心兽医需每年对每个供应商至少进行一次综合评估,重点是对实验动物质量进行评价,涵盖微生物质量、遗传质量和生理生化等表型。此外,综合评估还包括供应商的质量控制体系完善程度,供应商的售后服务保障和用户体验等。

1.3 实验动物基础物料选择与质量保障

1.3.1垫料:垫料,用于吸附水分和动物的排泄物,以维持动物自身和笼内环境的清洁卫生。为了防止对动物实验造成干扰,所选用的垫料应不含挥发性、刺激性物质,且对动物无毒害。啮齿类实验动物垫料主要包括杨木屑、玉米芯和纸卷。综合考虑取材难易程度及成本,美国多选用碎玉米芯作为垫料,而欧洲国家多选用白杨木屑作为垫料。一般认为,玉米芯垫料具有粉尘少,吸附氨类物质能力强[1],对动物及设备损害小的优点,但是舒适性差,不适合动物做窝,吸水性不好,且可能影响小鼠的代谢、免疫功能以及繁殖[2],常规可搭配纸卷加以改善[3]。纸卷由于成本较高,往往不单独使用。而杨木屑虽然便于动物做窝,利于保暖,降低能量消耗,更为动物喜爱[4-5],但是对设备损害较大,尤其是可能导致自动饮水系统的饮水水阀漏水。因此,为了使垫料兼顾良好的吸附性、舒适度,同时降低对设备的损坏,本中心对玉米芯分别搭配纸卷和杨木屑做垫料的实际使用效果进行比较后,进一步优化垫料组成成分,改进木屑为更轻盈松软的刨花[6]。目前本中心使用玉米芯搭配低粉尘杨树刨花作为大小鼠垫料,据繁育数据统计,在这种垫料饲养环境中本中心自繁C57BL/6J小鼠的产仔率稳定在8.5只/窝。

1.3.2饲料:饮食是实验动物健康和福利保障的重要组成部分,不同的饮食选择对小鼠的发育和肠道菌群有重大影响,并直接影响研究结果的准确性和可重复性。

饲料按照灭菌方法不同,主要分为60Co辐照灭菌和高压灭菌两种,已有研究表明60Co辐照灭菌法对饲料营养成分破坏较少,而高压蒸汽灭菌法对饲料营养成分破坏较多,尤其是会导致热敏感维生素(维生素A, B12, E等)的大量流失[7],因此本中心选用60Co辐照灭菌的饲料。然而,辐照后的饲料并不能保证完全无菌,辐照灭菌的效果与照射剂量和时间有关,还与病原污染的起始剂量相关。已有研究表明,饲料的制造过程并不能完全消除病原体,如果饲料病原载量过高,小鼠甚至有感染穆林帕沃病毒(murine parvovirus)的风险[8]。

因此,为了保障饲料质量,我们除了对购买饲料的外观进行严格检查,并跟踪每批次饲料的检测报告和质量合格证外,还不定期对饲料进行抽检,将抽检的样本送到第三方检测机构测试其营养成分和细菌含量,以确保各项指标符合国家标准。抽检频率为每年2～3次,抽检项目参考相关标准轮流进行,以保证全年能检测所有项目。严格的饲料质量把控,使我们中心小鼠分笼后体质量增长稳定,与JAX实验室相当(图1)。

1.3.3饮水:饮水同样是小鼠健康和福利保障中重要的组成部分。目前,行业内使用的实验动物饮水主要有反渗透水、酸化水(pH值为2.8～3.1)以及次氯酸水(游离氯0.2～1 ppm)。其中酸化水会导致肠道细菌数量及丰度下降[9],但是因其具有可抑制动物胃肠道病原体(例如假单胞菌)生长的优点,仍是最为广泛使用的啮齿动物饮水(如JAX实验室)。本中心二期新设施全部采用自动饮水装置,根据厂家推荐,采用的动物饮水是氯化水。为确保动物饮水符合国家实验动物环境标准,中心每月进行1次饮水的无菌状态检测,每年进行2次重金属含量检测。

2 实验动物专业技术服务项目的选择和建立

2.1 小鼠进出口业务

随着清华大学在生命科学领域国际地位的提升,校内研究者对全球小鼠资源的需求,以及开放共享自己小鼠的需要均日益增长,因此中心申请获得了从国内外院校、科研院所、实验动物资源机构(如JAX等机构)进出口活体小鼠(包括无菌小鼠)或其遗传物质的资质,义务帮助校内师生操作进出口业务,为清华大学生命学科与全球资源的联动提供便捷,全方位满足实验动物的进出口需求。

2.2 基因修饰小鼠技术服务

2.2.1小鼠生物净化:为保障本中心饲养的小鼠质量符合国标无特定病原体(specific pathogen free, SPF)的洁净等级,外来动物只有进行生物净化(bio-rederivation)后才可以进入屏障设施内的繁育房间。目前常用的净化方法包括体内交配进行胚胎移植(embryo transfer,ET)和体外受精(in vitro fertilization,IVF)后胚胎移植[10]。截至2021年,动物中心已经为190余位PI的4 100余个小鼠品系进行生物净化,其中仅2021年动物中心完成966个品系,其中自然交配方式271个,得到5 350枚2细胞期胚胎,生仔2 030只,体外受精方式695个,得到94 883枚2细胞期胚胎,生仔23 187只。每个品系从提出申请到进入屏障约为50 d,为生命学科的快速发展提供了保障。

2.2.2基因工程小鼠制作:2000年以来,CRISPR/Cas9基因修饰技术的问世,极大加速了对实验动物进行基因修饰的效率,进而催生了数以万计的基因工程动物模型。基于CRISPR/Cas9的优势,本中心及时将原有胚胎干细胞打靶(ES cell targeting)技术替换为更高效的CRISPR/Cas9制作方式。中心制作的基因修饰小鼠主要包括基因敲除(knockout,KO)、基因敲入(knockin,KI)以及转基因(transgene,Tg)。截至2021年为本校科研人员提供了347种基因工程小鼠,涉及基因300余个,提升了生命学科研究的时效性(表1)。

表1 2021年清华大学实验动物中心基因工程小鼠制作统计(n)

2.2.3体外受精(IVF)技术:为保证数据的可重复性、可比较性,实验中通常需要较大数量相同年龄、性别、品系的小鼠,若使用常规繁育的方式耗时耗力,中心通过快速扩繁方式帮助科研人员缩短获得相同实验小鼠的等待时间,以提高科研效率。IVF技术是实现快速扩繁的核心,将1～2只雄鼠活化后的精子与超排雌鼠的卵母细胞进行体外受精,然后将受精卵移植入假孕母鼠体内,一次可以获得大量出生日期接近的子代小鼠。相比传统的交配繁殖,IVF技术至少拥有以下优势:(1)无需等待生理性成熟时间,45 d即可获得多达百只子代;(2)子代小鼠出生日期一般相差2～3 d,便于实验分组;(3)可严格控制后代动物质量。截至2021年,中心共进行了123次IVF扩繁,获得子代20 007只,平均162只/次。

此外,如果科研工作者遇到小鼠无法正常交配繁殖,或小鼠突发不明原因死亡的状况,也能够通过IVF和卵巢移植技术及时挽救。在小鼠死亡后几个小时内,采集附睾尾或卵巢,再通过IVF或卵巢移植方式获得子代。目前,中心已经成功挽救10余例珍贵小鼠品系,有效降低了品系丢失的风险。

2.2.4小鼠附睾运输与保存及IVF服务:活体小鼠的长途运输对于温度和时效性要求高,且价格昂贵,甚至存在小鼠被微生物或寄生虫污染,以及运输途中小鼠逃跑或死亡的风险。本中心在国内首次建立了附睾、输卵管的冷藏运输法,可有效避免以上风险,且操作简单。目前,本中心既可提供低温保存附睾、冷链运送的服务,亦可接收对方冷链运输至清华的附睾,并提供IVF复苏附睾用于繁殖的服务。这样,既可以降低活体小鼠运输的成本和风险,又达到了生物净化(去除微生物和寄生虫污染)的目的。

2.2.5小鼠胚胎/精子冷冻保种与复苏服务:当一个研究课题取得阶段性成果后,一些小鼠品系可能会暂停使用,如果持续保持活体繁育,不仅占用时间和空间,同时也会浪费饲养和鉴定费用,为此我们提供了冷冻保种与复苏服务。冷冻保种即将小鼠的精子或胚胎冻存在液氮中(长期免费保存),待需要时,再将冻存的精子或胚胎复苏获得后代。目前,中心共有5个液氮罐(175 L/个),共存放精子1 660个品系,30 227麦管;冻存胚胎260个品系,共计66 493枚胚胎,已逐步发展成为一个小型共享的小鼠资源库。

2.3 动物质量保障、健康巡查、疾病诊断与护理等兽医技术服务

2.3.1动物质量检测和保障:为方便国际交流与小鼠出口业务,除国家标准(GB 14922.1—2011和GB 14922.2—2011)中要求的SPF级微生物和寄生虫的检测项目,以及一些必要时的检测项目外,本中心还按照国际惯例增加了其他国家地区的关注项目,包括Murine Norovirus(MNV)、K-virus(KV)、Lactate dehydrogenase-elevating virus(LDEV)、Mouse kidney parvovirus(MKPV)等。此外,结合中心历年动物质量检测结果,以及动物不同的使用目的,本中心将屏障设施划分为不同的防疫级别,并细分房间用途,定制化每个房间的检测项目和频率,保证所有项目全覆盖的同时,兼顾经济性,节约检测成本(表2)。

表2 2021年清华大学实验动物中心不同用途小鼠检测项目及频率设置

2.3.2动物健康巡查、疾病诊断及护理:为保障实验动物的健康,本中心兽医每周至少进行一次动物健康巡查,结合饲养人员及研究人员的反馈,检查并照料每只健康状态不良的动物。同时,中心会对动物健康问题进行分类总结,针对每一类健康问题,制定相应的标准操作规程,保障了动物福利和实验的顺利进行。此外,若中心出现动物死亡的情况,兽医会做好剖检记录,提供诊断结果,及时总结并整改潜在的影响因素,保障饲养和操作的准确性。

2.4 代管技术服务研发及MyMice小鼠管理软件制作

2019年受新冠疫情影响,大量科研工作者被隔离,动物中心及时推出了针对繁殖保种小鼠的免费代管技术服务,保障了科研人员小鼠的稳定繁殖,并进一步提升了小鼠质量的稳定性,促进了科研人员返岗后的“科研回归”。本中心的代管技术服务结合了我们自主开发的MyMice实验动物管理软件,实现了在校科研人员对小鼠的远程可视化管理,帮助他们从日常剪尾分笼等繁杂的小鼠管理工作中解放出来,同时也降低了饲养以外人员接触繁殖保种小鼠频次,便于更好地进行对微生物和寄生虫的控制。

目前中心自主研发并且已经在线运行的实验动物管理软件MyMice,可方便科研工作者随时随地查看实验动物信息、状态、所在笼位等内容,同时可以便捷的通过软件提出各种操作申请(剪尾、取鼠、建立繁殖笼、采血等实验操作),远程完成常规的实验动物管理工作。此外科研工作者还可以通过该软件和中心的技术员即时互动,以进行特殊需求说明。MyMice采用B/S结构设计,拥有良好的跨平台能力和兼容性,只需设备支持浏览器和网络服务,即可使用。且该软件的操作界面简单直观,无论是代管技术员还是普通用户,经过简单的培训即可快速掌握,为实验动物管理工作提供便利。

2.5 表型分析中心的建立

为了帮助清华大学在校师生对实验动物的表型进行分析,本中心建立了表型分析平台,其中包括小动物能量代谢系统、小动物活体成像系统、小动物活体和细胞的X-Ray辐照系统、组织病理制片和摄片系统。此外,随着我国神经科学领域的蓬勃发展,本中心在二期启用后对一期设施进行改造,并成立行为学表型分析系统,旨在为神经科学领域的科研工作者提供小动物行为学研究平台。

2.5.1小动物能量代谢系统:小动物能量代谢系统主要包括小动物体脂成分分析(EchoMRI)和TSE八通道小动物代谢监测系统(含小鼠跑步机模块)。可以为糖尿病、肥胖、内分泌等代谢相关疾病或药物筛选、药理研究以及营养学相关研究提供服务。

2.5.2小动物活体成像系统:小动物活体成像系统主要包括用于活体荧光成像的IVIS Lumina II和IVIS Spectrum 3D,以及Quantum MicroCT。小动物活体荧光成像系统可以应用于材料学、神经科学、代谢学、免疫学等的研究和相关疾病药物的筛选。小动物MicroCT成像系统利用X线进行三维断层扫描成像,其使用极低的X线剂量实现对活体动物的长时程成像,此外还可以与IVIS Spectrum 3D联用,进行数据融合,可广泛应用于骨骼、器官、软组织、肿瘤、心血管等相关结构变化的研究。

2.5.3小动物和细胞X线辐照系统:本中心有基于X线的辐照装置(Rad Source RS2000 pro),能为活体小动物以及细胞提供辐照服务,目前已广泛应用于干细胞、骨髓移植、肿瘤学、免疫学、基因组学等的研究和相关药物的研发中。基于辐照操作的特殊性,本中心从事放射相关工作人员均需完成放射防护和有关法律知识培训,并获得放射人员操作资格证书。此外,中心的辐照仪每季度会请专业机构进行校准及设备维护,以保证使用安全与辐照剂量的准确性。

2.5.4组织病理制片、摄片系统:本中心组织病理制片、摄片于病理室进行,病理室具有全自动脱水机、石蜡包埋机、全自动组织细胞多功能染色机、全自动盖片机、组织切片机(如石蜡切片机、冷冻切片机、震荡切片机)以及显微成像系统,可以提供从制片、染色到摄片的全周期系列服务。2021年病理室月均包埋1 495块,切片2 535张,HE染色1 650张,总计为校内109位PI,353名学生提供了病理学相关服务。

2.5.5行为学表型分析系统:行为学表型分析中心占地237 m2,包括19个测试房间,已支持至少34种行为学范式的测定,其中包括基本冷、热、痛觉(Von Frey纤维丝测痛仪、冷热板)与震惊反射测试,基本运动功能测试(跑步机、转棒仪、爪抓力测试、平衡木、步态分析仪),焦虑(旷场实验、高架十字迷宫实验、明暗箱实验)以及抑郁(强迫游泳、悬尾、糖水偏好)相关的情绪测试,社交障碍模型的制备和测试(慢性社交挫败应激模型的制备、管型社会支配实验、三箱社交测试),学习记忆测试(如水迷宫、巴恩斯迷宫、Y迷宫、条件性恐惧实验等),生物节律监测系统(自主活动转轮系统)和气候对动物影响的监测系统。这些行为范式除了广泛应用于神经科学的研究,还应用于免疫学、结构生物学、材料科学、环境科学以及计算神经科学等领域。

2.6 其他新技术的开发

近年来,肠道菌群的相关研究已成为生命科学研究中的热点领域之一,对无菌小鼠以及小鼠的无菌化服务与日俱增。为跟上科研工作者步伐,本中心成功建立了无菌小鼠繁育体系。繁育环境通过了北京市科学技术委员会颁发的实验动物使用许可证(隔离环境:小鼠)。无菌小鼠通过了多次检测,质量符合无菌要求。

3 环境控制系统的保障和维护

设施环境的洁净度、房间压差、温度、相对湿度、氨气浓度及照度等是保障实验动物质量的重要环境参数,因此进行屏障环境、实验动物设施的日常维护以确保其持续正常运行,同时提供具有标准化和窄幅变化范围的环境空间是必要的。

为了实现以上目的,本中心的屏障设施交由维保专职技术人员运行管理,全年24 h监控设施设备的运行状态,确保出现异常情况时能够第一时间响应,并及时调试至正常状态,保障设施环境的稳定性。

4 人才培养及队伍梯队建设

本中心目前工作人员77名,其中以博士、硕士为核心的技术人员14名,占18%,主要从事兽医、基因修饰小鼠制作、平台大型仪器管理和表型分析、人员培训等工作。此外,本科、大专人员16名,占比21%,主要为核心技术人员提供辅助,在核心技术人员的安排以及指导下开展具有一定技术难度的工作。

本中心工作内容多样,主要通过平台主管进行分级管理,并且每年对平台主管进行考核,破除“唯学历”“唯职称”的用人弊端,建立正确的用人导向。针对科研平台技术团队中事业编制和非事业编制人员并存的实际状况,结合高校人事制度改革,本中心配合学校在人员聘用与合同管理、技术职务评审与内部职级评定、薪酬及休假等方面进行了一些探索性的趋同化管理实践。不断改良管理方式,以保持不同编制类型人员技术职务评审的公平性,保证工作人员的个人发展空间,不断提高自身技术服务水平,提高设备利用效率和平台的技术支撑能力,进而增强职业认同感,保持高昂的工作积极性。

5 结语

清华大学实验动物中心自2009年成立,已经走过十余年。随着大生命科学相关学科的发展,科研工作者的需求逐渐由基础、单一化向高阶、多元化升级,我们中心始终和清华大学的科研工作者并肩同行,为我校实验动物研究提供良好的平台保障。实验动物中心的发展离不开学校各相关部门的大力支持和帮助,是多部门协力共筑的科研基石。下一个十年,实验动物中心将立足学校的学科发展要求,进一步完善中心功能并提升服务质量,全力为学校的科研教学工作发展保驾护航,为清华大学生命学科力争世界一流的科研目标提供强有力的支撑。