亓 妙 徐晨曦 吕玲娟 杨志宏 杨润梅

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所药理毒理研究中心,北京 100193)

高脂血症是一种以机体血液脂质水平异常为特征的常见代谢性疾病,也是引起动脉粥样硬化、心脑血管疾病及脂肪肝等的重要致病因素。它对人体的损害是隐蔽、逐步、进行性的,是一种全身性的疾病。随着人们饮食结构的改变,高脂血症的发病率明显上升,成为了目前常见临床疾病[1],而且由其诱发的各类疾病已严重威胁人类身体健康。建立稳定、理想的高脂血症模型是研究疾病的重要基础,也是降脂新药研发的需要。

大鼠是目前最常用的实验动物,具备饲养方便、成本较低、取血量大等特点,也常用于建立高脂血症动物模型,广泛的用于降脂药物的研究[2-3]。通过文献[4-6]调研,我们发现大鼠的高脂饲料配方种类众多,建模效果也不稳定。因此本实验在饲料中添加不同比例的胆固醇、猪油、蔗糖、果糖和酪蛋白等常用造模剂,目的在于找到一个能诱导稳定高脂血症模型的大鼠高脂饲料配方,为降脂药物的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:SPF级雄性SD大鼠60只,体质量200～220 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2016-0006】。饲养于中国医学科学院药用植物研究所动物中心屏障环境【SYXK(京)2017-0020】中。温度:21～25 ℃,湿度:40%～60%,12 h光照阴暗交替。所有实验操作均按照该中心的操作指南执行,并得到中国医学科学院药用植物研究所动物伦理委员会的许可,伦理审批号:SLXD-20200918027。

1.1.2实验饲料:普通饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供,高脂饲料从河南省环宇禾康生物科技有限公司自行订购,总共有五种配方。配方见表1。

表1 高脂饲料配方表(%)

1.1.3试剂:血清总胆固醇(total cholesterol, TC)检测试剂盒,批号191671,有效期至2021-06-23;甘油三酯(triglyceride, TG)检测试剂盒,批号191051,有效期至2021-08-26;低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)检测试剂盒,批号191321,有效期至2020-09-26;高密度脂蛋白-胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)检测试剂盒,批号191211,有效期至2020-10-13,以上试剂盒均来源于中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 方法

大鼠适应饲养3 d后开始实验,随机分为正常组、模型1组、模型2组、模型3组、模型4组、模型5组,10只/组。正常组给予普通饲料,其余各模型组给予相应配方的高脂饲料,配方见表1。自由饮水,连续喂养6周。每日记录大鼠进食量,每周称重。分别于造模1、2、4及6周后,禁食不禁水12 h,大鼠麻醉后眼眶内眦后静脉丛采血约0.5 mL,血样4 ℃下静置2 h、3 500 r/min离心15 min取血清,测定TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。过量麻醉处死大鼠,剖取肝,检测肝中TG、TC的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 进食量

与正常对照组大鼠相比,模型2组、模型3组和模型5组大鼠的进食量明显减少,其中,模型2组从造模第1周持续至第6周,差异具有统计学意义,模型3组大鼠在造模第1、3、4、5和6周差异具有统计学意义,模型5组大鼠在造模第3、4和6周差异具有统计学意义。其余模型组大鼠进食量与正常组比较无明显差异(表2)。

表2 各组大鼠进食量

2.2 体质量

造模前各组大鼠体质量无明显差异。与正常组大鼠相比,造模1周后开始,持续至6周,模型3组大鼠体质量明显降低,差异有统计学意义;其余各模型组大鼠体质量与正常组大鼠比较无明显差异(图1)。

注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.3 血清脂质含量

与正常组大鼠相比,造模1周后至6周,各模型组大鼠的总胆固醇(TC)含量,与正常组相比都有所升高,但只有模型2和模型3组大鼠与正常组的差异一直有统计学意义(图2);造模1周后持续至6周,各模型组大鼠血清中的低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)含量与正常组相比均明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)(图3);各模型组大鼠血清中的高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)含量与正常组相比均有所降低,其中模型4组和5组从造模1周后持续至6周,差异均有统计学意义(图4);与正常组相比,造模1周后持续至4周,模型1、2、3组和5组大鼠血清甘油三酯(TG)含量均明显降低,差异有统计学意义(图5)。

注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

注:与正常组比较,*P<0.001

注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01

注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 肝指标

与正常组大鼠相比,各模型组大鼠肝中的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量明显升高(图6),肝重系数明显增大(图7),差异均有统计学意义。同时在解剖过程中可以观察到,正常组大鼠肝呈表面暗红,边缘光滑锐利且弹性好,而各模型组大鼠的肝与正常组大鼠相比,均呈淡黄色,无光泽,体积均匀性增大,肝质地较硬,边缘钝圆,弹性变差。

注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.001

注:与正常组比较,*P<0.01,**P<0.001

3 讨论

机体内胆固醇的来源主要有两条途径,一是内源性的生物合成,二是外源性的饮食摄入[7]。根据参考文献[8-9]可知,由于胆固醇结构的特点其无法在细胞内被分解,过量摄入容易造成机体内胆固醇代谢紊乱,最终导致非酒精性脂肪肝、高脂血症、动脉粥样硬化等。在饲料中添加胆固醇增加了大鼠的外源性胆固醇的摄入,能够导致其在细胞内或是血管内累积,从而形成高胆固醇血症和脂肪肝。猪油是一种动物脂肪,主要由饱和脂肪酸甘油酯与不饱和脂肪酸甘油脂组成。胆盐是胆汁酸分别与钠或钾结合形成的盐类,有着能使脂肪变成细小的脂肪微滴的生理功能,大大增加了脂肪与酶的接触面积,促进了脂肪的分解与吸收[10],因此在高脂饲料中添加胆盐,来促进大鼠对脂肪的消化和吸收。与正常组相比,模型2和3组的血清总胆固醇含量在造模1至6周持续保持升高,且差异有统计学意义,而其他组别的血清中总胆固醇的含量在造模2周达到峰值后,造模4周和6周后与正常组比较均无明显升高。比较各高脂饲料的配方可发现,各配方中胆固醇的添加量都是1%,表明胆固醇不是造成各模型组大鼠血清总胆固醇含量有差异的原因。配方2和3高脂饲料跟其他配方高脂饲料的共同差异在于添加了20%果糖和10%猪油,由此我们分析造成模型2和3组大鼠血清总胆固醇含量明显升高的原因是在添加1%胆固醇和0.3%胆盐基础上,20%果糖和10%猪油共同发挥了作用。

根据参考文献[11]的研究发现,补充果糖的大鼠会出现高甘油三酯血症,骨骼肌和内脏白色脂肪组织中的VLDL受体和脂蛋白脂肪酶表达降低。有研究[12]发现喂食高蔗糖(68%)和高果糖(60%)饮食的Wistar大鼠在3周和8周后TG水平分别增加了4倍。上述文献表明,饮食中添加果糖和蔗糖都能够成功建立大鼠高甘油三酯血症模型,所以本实验我们在不同组别中分别添加了果糖和蔗糖来进行诱导造模。但实验结果发现各模型组大鼠血清中TG含量一直没有升高,反而呈下降趋势,与文献报道并不一致。推测可能是因为高脂饲料诱导,外源性脂肪和胆固醇的大量摄入,对大鼠内源性甘油三酯合成形成了抑制,或同时抑制了甘油三酯从肝向血液的释放[13]。且大鼠血浆TG清除率较高,不易建立稳定的高TG模型[14]。

同时,此次实验中,模型2组“20%果糖+10%猪油+1%胆固醇+0.3%胆盐+5%酪蛋白+63.7%基础饲料”、模型3组“20%果糖+10%猪油+1%胆固醇+0.3%胆盐+68.7%基础饲料”和模型5组“20%蔗糖+10%猪油+1%胆固醇+0.3%胆盐+5%酪蛋白+68.7%基础饲料”的大鼠进食量低于正常组大鼠且具有统计学意义,可能是这三个配方饲料中都添加了10%猪油,饲料口感油腻,导致适口性下降,大鼠进食量减少。

各模型组中只有模型3组大鼠体质量与正常组大鼠比较有明显下降,可能是因为配方3高脂饲料中未添加酪蛋白,而酪蛋白是动物乳汁中含量最高的蛋白质,可为机体提供生命活动和生长所需要的必需氨基酸。有研究[15]表明,酪蛋白对于大鼠的生长有一定的促进作用,所以我们推测由于模型3组大鼠未添加酪蛋白,大鼠摄入的蛋白质较低,可能影响到大鼠身体发育生长,从而导致配方3组体质量增长率低。

综上所述,本次实验发现,与正常对照组大鼠相比,通过单纯的高脂饲料诱导,造模6周后,模型2和模型3组大鼠血清中总胆固醇(TC)含量显著升高,各模型组大鼠血清中的低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)含量均显著升高;且与正常组大鼠相比,各模型组大鼠肝中的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量也显著增加,表明配方2和配方3高脂饲料能够成功建立稳定的大鼠高胆固醇血症模型。本研究为降脂药物筛选和评价提供了一种操作简便、低成本、稳定的动物模型,特别是针对治疗高胆固醇血症的药物。