鲍 捷 ，任晓蕾 ，郭宝松 ，梁会朋 ，林心萍 ，张素芳

（1. 大连工业大学国家海洋食品工程技术研究中心，大连 116034；2. 大连工业大学食品学院，大连 116034）

0 引 言

大豆是中国重要经济作物，其中2020 年辽宁地区大豆产量可达3 008.1 kg/hm2[1]。大豆中富含的大豆蛋白不仅可以作为添加剂改善食品起泡性[2]、乳化性[3]等功能特性，还因其氨基酸组成与牛奶相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均较丰富，可作为动物蛋白的良好替代品[4]。与动物蛋白相比，大豆蛋白的吸收利用率较低，需经过水解成大豆多肽或氨基酸，才能提高其消化吸收效率[5]。此外，经过水解的大豆蛋白溶解性、稳定性等功能特性也明显提高[6]。目前常用的大豆蛋白水解方法有酸法水解、碱法水解和酶法水解，其中酸碱水解法会对丝氨酸等氨基酸造成破坏，营养成分损失大[7]，还会伴随不良副反应，不适用于食品加工。因此，常选用酶法水解获取大豆多肽或氨基酸[8]，该方法广泛应用于食品[9]、工业[10]等领域。

研究表明，商业蛋白酶对底物的要求较高且生物利用度低，水解后的大豆蛋白含有苦味，商业蛋白酶并不完全适用于大豆蛋白的水解和加工[11]，从大豆发酵产品筛选产蛋白酶微生物进行酶法发酵可有效解决这一问题。传统农家酱是以大豆为主要原料的传统发酵食品，距今已有2000 余年历史，随着自然驯化，其中菌株天然适合大豆食品的加工，其经由炒制、制砖、发酵、下酱等多个流程制得，具有浓郁豆香和独特风味[12]。且因传统农家酱常以家庭为单位进行酿造，所以根据发酵环境的不同，微生物种类丰富，包括曲霉属（Aspergillus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）等[13]。从传统农家酱中筛选具有蛋白酶活性的菌株，对大豆蛋白适应性更强，可提高大豆蛋白的水解效率，增强人体对大豆蛋白的消化吸收，具有很高的利用价值和良好的挖掘潜力。

本文从东北传统农家酱中筛选、分离出8 株产蛋白酶菌株，采用形态学和分子生物学方法进行菌株分类鉴定及抗生素敏感性、溶血性和吲哚试验等安全性评价，并将8 株产蛋白酶菌株应用于豆浆处理。分析了菌株发酵处理前后的豆浆中可溶性肽、氨基态氮、水解度3 项指标的变化，探讨了8 株产蛋白酶菌株对豆浆中大豆蛋白的水解效果。以期为大豆保健功能食品的开发提供潜在应用菌株及理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材 料

东北传统农家酱，购自辽宁省抚顺市；大豆，购自北大荒旗舰店。

1.1.2 试 剂

LB 培养基、哥伦比亚琼脂培养基、脱纤维羊血、蛋白胨水，购自高科技工业园海博生物技术（青岛）有限公司；引物27F、1492R，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Genview 琼脂糖，购自Genview Scientific Inc.；茚三酮（化学纯），购自大茂（天津）化学试剂厂；C8H5KO4、CuSO4、K2SO4、H2SO4、Na2CO3、NaOH、酚酞、甲醛溶液；福林酚试剂、酪蛋白等，购自索莱宝科技（北京）有限公司。大豆分离蛋白，购自源叶生物（上海）科技有限公司。药敏纸片，购自比克曼（湖南）生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

产蛋白酶菌株筛选培养基：培养基组分A：琼脂40.0，121 ℃灭菌15 min，趁热加入至平皿（约至平皿高度的1/8），冷却至室温后放置牛津杯（内径：6 mm，外径：8 mm，高：10 mm）；培养基组分B：NaCl 20.0，胰蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，琼脂40.0（固体培养基），pH 值为(7.0±0.1)，121 ℃灭菌15 min；培养基组分C：大豆分离蛋白 30.0，90℃灭菌5 min。培养基组分B、C 混合后冷却至50℃左右，倒入放置好牛津杯的琼脂平皿中，完全凝固后取出牛津杯；

溶血性验证培养基：参照哥伦比亚琼脂培养基产品说明书配置；

稀福林试剂：福林酚试剂10 mL、去离子水定容至20 mL。

1.2 仪器与设备

光学显微镜，德国徕卡显微系统；PCR 仪，美国伯乐公司；水平电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像仪，以色列DNR 公司；全自动凯氏定氮仪，欧莱博科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的筛选和分离纯化

称取豆酱样品1 g，用5 mL 无菌水重悬，将悬液进行倍比稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释度液体各100 μL，均匀涂布于LB 固体培养基上，37 ℃静置培养12 h，选择菌落数小于300 的平板，挑取不同形态的单菌落，于LB 固体培养基划线分离纯化3 代，直至获得纯培养。挑取单菌落接种于LB 液体培养基中，200 r/min、37 ℃培养至OD600=0.6。取1.5 mL 菌液12 000 r/min 离心3 min，取上清10 μL 滴加于产蛋白酶菌株筛选培养基加样孔内，置于37 ℃静置培养，每4 h 观察一次，挑取透明水解圈直径最大的8 株菌，保藏备后续分析。

1.3.2 蛋白酶粗酶活的测定

将上述8 株菌培养至OD600=0.6，12 000 r/min 离心3 min，取上清参考国标SB/T 10 317-1999 中的福林法，测定菌株发酵上清液的碱性蛋白酶酶活[14]，蛋白酶活力单位规定为：以酪蛋白为底物，每分钟催化生成1 μg 酪氨酸的酶量为一个活力单位（U）。公式如下：

式中X为样品的酶活力，U/mL；A为样品平行试验的平均吸光度；K为吸光常数（K=97.59，实验室测定值）；n为稀释倍数。

1.3.3 菌株鉴定

1）形态学鉴定

对筛选到的8 株菌进行形态学和光学显微镜观察，记录菌落大小、形状、质地、边缘、光泽和颜色等形态特征，并采集显微图像。

2）分子生物学鉴定

菌株基因组提取方法参考文献进行 [15] 。16S rDNA PCR 扩增采用通用引物27F 和1492R[16]。PCR 反应体系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（20 μM）各1 μL，基因组模板（50 ng/μL）1 μL，灭菌水23 μL。PCR 反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30 次循环，最后72 ℃延伸5 min。

取4 μL 的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，条带清晰符合预期大小的扩增产物送至测序公司测序。测序结果在美国国家生物信息中心（NCBI）数据库中进行Blastn。基于比对结果进行分离菌株分类鉴定。

1.3.4 菌株安全性试验

1）抗生素敏感性试验

使用K-B 纸片法对芽孢杆菌的抗生素敏感性谱进行了表征[17]。冻存菌株用LB 固体培养基活化两代后，挑单菌落接种于LB 液体培养基，37 ℃，200 r/min 培养至OD600=（0.6±0.1），取100 μL 菌液均匀涂布在LB 固体培养基上，液体吸收完全后将抗生素药敏纸片贴于平板上，保持纸片间的距离不小于24 mm。静置培养12 h 后测量并统计抑菌圈直径，分析其是否耐药。评价等级：耐药R（≤5 mm），中度敏感MS（＜5～＜11 mm）或敏感S（≥11 mm），每组试验3 个平行。

2）溶血性试验

为评价8 株菌的安全性，进行溶血性试验[18]。溶血素可以将红细胞破裂溶解，形成溶血环，许多细菌的致病性都与溶血特性相关。溶血性分为α溶血、β溶血与γ溶血，前两者表现为有草绿色溶血环和完全透明溶血环，γ溶血无溶血环即不溶血。筛选出的8 株菌株在LB固体培养基上活化一代，挑单菌落划线于溶血性验证培养基中，在37 ℃静置培养18 h，观察是否溶血，以金黄色葡萄球菌ATCC 25 923 作为阳性对照。

3）吲哚试验

大豆中富含色氨酸，产色氨酸酶的微生物能够分解其中色氨酸产生吲哚，吲哚的产生通常伴随不良气味的产生，影响食品风味[19]。为进一步评价8 株菌的安全性，进行了吲哚试验分析[20]。筛选出的8 株菌株LB 固体培养基上活化一代后，挑单菌落接种蛋白胨水生化反应管，置37 ℃静置培养18 h，加入Kovacs 氏靛基质试剂8～10 滴，同时设空白对照试验。观察试验结果，如有吲哚存在，呈现玫瑰红色，判定为阳性反应；滴加试剂后不变色为阴性反应。

1.3.5 产蛋白酶菌株在豆浆中的应用

1）豆浆制作

取200 g 已浸泡10 h 的大豆，加水至1000 mL，豆浆机研磨破碎后，采用0.3 mm 筛过滤豆浆于100 mL 锥形瓶（每瓶装50 mL 豆浆）中，121 ℃灭菌15 min。接种筛选获得的产蛋白酶菌株，接种前活化两代，调节菌液浓度至OD600值为0.6，1%接种量接种于豆浆，37 ℃、200 r/min 摇床培养18 h。

2）可溶性肽

标准曲线的绘制选用酪蛋白。取1 mL 发酵豆浆，按照JITPAKDEE 的方法[21]进行三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）可溶性肽测定。

3）氨基态氮与水解度

参考徐鑫等[22]的方法测定发酵豆浆的氨基态氮。取发酵豆浆，以去离子水做空白对照，利用甲醛滴定法，记录使用NaOH 标准溶液（0.1 mol/L）的毫升数。并带入公式：

式中V为样品滴定消耗氢氧化钠体积，mL；V0为空白样品消耗氢氧化钠体积，mL；N为NaOH 标准溶液浓度，mol/L。

按《食品安全国家标准，食品中蛋白质的测定：GB 5 009.5-2016》凯氏定氮法进行蛋白质含量的测定，参考吴成[23]的方法进行水解度的测定。其中，W0=0.178，以未处理豆浆氨基氮含量计，W1以产蛋白酶菌株处理豆浆氨基氮含量计，W2为豆浆凯氏定氮得到，结果为2.01 g/100 mL。公式如下：

式中W0为未发酵豆浆中游离氨基酸的浓度，g/100 mL；W1为发酵豆浆中酶解出的游离氨基酸的浓度，g/100 mL；W2为底物浓度，g/mL。4） 感官评定

感官评定分为5 个维度，4 个等级，使用的描述词汇及评分标准见表1。招募34 名食品专业研究生（11 名男生、23 名女生）组成感官评定小组。测试样品被盛装于透明一次性杯中，杯上无样品名称，仅有数字编号，品评顺序随机。评分时去掉最高分与最低分后取算数平均值。

表1 发酵豆浆感官评定描述及评分标准Table 1 Description and scoring criteria for sensory evaluation of fermented soymilk

2 结果与分析

2.1 豆酱中产蛋白酶菌株的分离与鉴定

2.1.1 菌落的形态学观察结果

以东北传统农家酱为原材料，通过蛋白酶活性筛选平板分离出24 株具有蛋白酶活性的菌株，取含蛋白酶的发酵上清滴加于产蛋白酶菌株筛选培养基。编号后用全自动菌落计数仪（法国）进行水解圈直径测量，结果如图1 所示，菌株BJ-2 水解圈最大，直径为28.7 mm。

图1 传统农家酱中菌株水解大豆分离蛋白水解圈Fig.1 Hydrolysis ring of strains in traditional farmhouse sauce to hydrolyze soy protein isolate

选择其中水解圈直径最大的8 株菌，进行了菌落形态观察和显微镜检，通过形态学观察可知，8 株菌均呈乳白色，均不透明；6 株表面光滑且缘整齐，2 株表面粗糙且边缘模糊；通过镜检可知，8 株菌均为短杆菌，且大多单个存在，具体的菌落形态学描述详见表2。

表2 传统农家酱中菌株形态学特征Table 2 Morphological characteristics of strains in traditional soybean paste

2.2 蛋白酶酶活的测定

从图2 可以看到，菌株产蛋白酶酶活范围为15.03～35.24 U/mL，其中菌株BJ-15 产量最高，菌株BJ-2 产量最低。菌株测量酶活时选取的是碱性蛋白酶的测定方法，蛋白酶根据活性部位、生理功能、水解条件等分类条件的不同种类极多，其中碱性蛋白酶对大豆蛋白的水解效果相比其他蛋白酶更好[24]，且几乎所有产蛋白酶微生物都能产生碱性蛋白酶[25-26]，应用也更广。芽孢杆菌所产蛋白酶可总结为两类[27]，一种为只含有碱性蛋白酶的Carlsberg 型碱性蛋白酶；另一种为同时含有碱性蛋白酶和中性蛋白酶的Novo 型碱性蛋白酶。两者相较，Carlsberg 型碱性蛋白酶底物专一性更广泛，且更加稳定。此外，菌株在测量酶活时，应国标要求，选取的底物为酪蛋白，试验结果表明菌株对酪蛋白也有水解能力，未来可对菌株所产蛋白酶的底物种类进一步研究，或将这些菌株应用于含酪蛋白的食品中。

图2 传统农家酱中菌株蛋白酶酶活Fig.2 Protease enzyme activity of strains in traditional soybean paste

2.3 菌株的分子学鉴定

提取8 株产蛋白酶菌株的基因组为模板，利用引物27F 和1492R 进行16S rDNA 片段扩增，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，所有泳道均在1 500 bp 左右出现了一条清晰条带。PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI 上进行Blastn分析。

测序结果如表3 所示，8 株菌从属层面来看，均为芽孢杆菌属；从种层面看，可分为6 种，分别为漳州芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌和特基拉芽胞杆菌。枯草芽孢杆菌、漳州芽孢杆菌[28]广泛应用于产碱性蛋白酶研究；贝莱斯芽孢杆菌[29]、暹罗芽孢杆菌[30]、特基拉芽胞杆菌[31]已报道具有抑菌活性，常用于农业或食品保鲜；另外甲基营养芽孢杆菌[32]还具有降解有害物质、保护治理环境的作用。董丹等[33]从发酵初期豆瓣酱中筛选出39 株芽孢杆菌，其中5 株产蛋白酶的芽孢杆菌分别为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和Sonorensis芽孢杆菌，本文筛选菌株与已报道的食源性产蛋白酶菌株在属水平较为一致。

表3 传统农家酱中产蛋白酶菌株16S rDNA 序列分析结果Table 3 Results of 16S rDNA sequence analysis of proteaseproducing strains in traditional soybean paste

2.4 安全性试验

2.4.1 抗生素敏感性试验

因为抗生素的滥用，菌株耐药性逐渐提高，为避免超级细菌的产生，抗生素敏感试验至关重要。前文筛选得到的8 株芽胞杆菌的抗生素敏感性如表4 所示。8 株芽孢杆菌对受试抗生素敏感性基本一致，表现为对庆大霉素、氨苄西林和青霉素中度敏感，对其他抗生素敏感。本实验菌株均有抗生素敏感性，说明安全性均较高，可以用于后续研究。

表4 传统农家酱中产蛋白酶菌株耐药性评价Table 4 Evaluation of drug resistance of protease-producing strains in traditional soybean paste

2.4.2 溶血性、吲哚试验

试验结果显示，所分离的8 株菌在血平板上37 ℃培养18 h 时，均无溶血圈产生，说明8 株菌均不产溶血素；8 株菌在蛋白胨水生理生化管37 ℃培养18 h，加入Kovacs 氏靛基质试剂后，均无颜色变化，说明8 株菌均不会分解色氨酸产生吲哚。

2.5 产蛋白酶菌株在豆浆中的应用

2.5.1 可溶性肽

从图3 得知，用选取的8 株芽孢杆菌处理后的豆浆可溶性肽含量范围在170.4～200.9 μg/mL 之间，相较于未发酵豆浆增加了16.4%～37.2%。在确定可溶肽增加的基础上，后续可以针对肽段的长度、种类等进行更深入的研究，或是通过与其他酶活性菌株混合发酵，进一步改善发酵豆浆品质。通过微生物分泌的各种酶，传统发酵大豆制品中的蛋白质被水解成小肽，除了能方便吸收外，还能给豆浆增添保健效果，赋予独特风味[34]。如一些菌株可以产生大豆血管紧张素转化酶抑制肽，这种酶具有降压潜力，在调节血压方面具有重要作用[35]；一些菌株还可以产生抗氧化肽[36]，起到抗氧化效果。

图3 产蛋白酶菌株处理后豆浆可溶性肽变化Fig.3 Changes of soluble peptides in soymilk after treatment by protease-producing strains

与蛋白酶酶活结合来看，部分菌株在筛选平板上水解圈大，蛋白酶活力高，但可溶性多肽含量较低，主要有两点原因。第一，本文测定的蛋白酶酶活为碱性蛋白酶酶活，酶活测定缓冲液pH 值为10，但实际豆浆处理体系大约pH 值为6，两者pH 值不一样，所以蛋白酶酶活较高的菌株在pH 值为6 的豆浆中应用时，酶活并不一定最好。第二，蛋白酶的底物谱广，但与不同底物的亲和力不同。测定蛋白水解圈时底物是市售大豆分离蛋白（主成分是β-伴球蛋白和球蛋白），测定碱性蛋白酶酶活时所用底物是市售酪蛋白，但在实际豆浆发酵体系中，用的是大豆总蛋白，包括球蛋白[37]、清蛋白[38]等。底物不同，即使是同种酶，也会表现出不同的酶活差异。

2.5.2 豆浆氨基态氮及水解度测定

芽孢杆菌发酵豆浆时，蛋白质水解主要发生在对数生长期，与豆浆pH 值的变化、风味等有关。如图4a 为不同产蛋白酶菌株处理后豆浆氨基态氮变化，图4b 为不同产蛋白酶菌株处理后豆浆水解度变化，蛋白酶处理后，豆浆的氨基态氮和水解度显著增加，效果最好的为菌株BJ-6 处理豆浆，氨基态氮上升了10.87%，水解度为23.49%。本节数据趋势同样与水解圈大小及蛋白酶活力不一致，原因与2.5.1 相似，且现有许多文献的结果也有类似结果。王朋朋[39]筛选得到6 株产蛋白酶的曲霉，其中菌株A6、A8、A15、B3 的蛋白酶酶活分别为1 572.54、1 324.46、1 456.24、1 378.89 U/g，但氨基态氮含量分别为23.57、20.38、20.17、21.57 mg/g，可以看到其结论与本文类似，蛋白酶酶活与氨基态氮含量也无相关性。邓维琴等[40]从豆瓣酱中筛选出17 株曲霉，其中菌株PCSM002 的蛋白酶酶活大于菌株PCSM001，但在实际应用中，PCSM001 发酵豆瓣酱的氨基态氮含量高于PCSM002 发酵豆瓣酱。

图4 产蛋白酶菌株处理后豆浆氨基态氮、水解度变化Fig.4 Changes of amino peptide nitrogen and protein hydrolysis degree of soymilk after treatment by protease-producing strains

蛋白水解度除与菌株所产蛋白酶的酶活有关外，还与菌株在豆浆中的生长速度、微生物产酶种类、豆浆的品质等有关[41]。例如：微生物发酵产蛋白酶，将蛋白水解为小肽和氨基酸的同时，微生物也会利用小肽和氨基酸进行生长繁殖，消耗水解产物；又或是微生物除产蛋白酶外，同时产生转氨酶、脱羧酶等酶系，将氨基酸转化为胺类化合物；而豆浆的品质则会影响豆浆中的蛋白含量，从而影响水解度。在发酵豆制品中，水解度是监测蛋白水解的重要参数，能够反映蛋白质的变化情况、营养价值和功能特征。

2.5.3 感官评定

从组织状态、色泽、气味、口感和滋味5 个方面对不同菌株发酵的豆浆进行评价，结果见图5。其中发酵后豆浆的组织状态和色泽较发酵前均有所提高，但气味，滋味下降。所有感官评定员反馈，豆浆发酵后豆腥味显著减少，并有酸味生成，品尝时入口略苦，但有回甘，类似豆汁口感。其中，豆浆的豆腥味主要源于脂肪氧化生成的醇、醛、酮类化合物[42]，经菌株处理后能有效降低这些具有异味的小分子化合物[43]。而入口略苦可能是因为蛋白质在水解过程中，随着小分子多肽的生成，疏水性氨基酸残基暴露，苦味的程度与疏水氨基酸含量有关，疏水氨基酸在多肽中含量越多，苦味越重[44]。而酸味的生成与回甘滋味可能与大豆蛋白水解后，游离氨基酸含量上升，风味物质的释放有关[45-46]。

图5 产蛋白酶菌株处理后豆浆感官评定结果Fig.5 Sensory evaluation of soymilk after treatment of proteaseproducing strains

总体来看，菌株BJ-2、BJ-20 为发酵剂的两个发酵组评价较好。其中，BJ-2 发酵豆浆的组织状态和色泽分别得分9.5 和8.3 分，BJ-20 发酵豆浆的组织状态和色泽分别得分9.5 和8.0 分，较发酵前相比明显改良。感官评定员反馈，两种发酵豆浆的组织状态均匀，未见悬浮颗粒物，且呈显乳白色，略带光泽。这可能是因为随着水解度的提高，大豆分离蛋白的相对分子量逐渐减小，其平均粒径、黏度、持水性降低，溶解性和持油性显著提高[47]。

3 结 论

本文从东北传统农家酱中筛选出产蛋白酶的菌株8 株，经鉴定后发现8 株菌均为芽孢杆菌。在确定其安全性后，利用8 株芽孢杆菌处理豆浆。发现相较处理前，豆浆处理后可溶性肽质量分数增加了16.4%～37.2%，处理效果最佳的豆浆氨基态氮含量上升了10.87%，水解度为23.49%。此外，这8 株菌还可有效改良豆浆口感，为豆浆赋予独特风味。

本文为应用于豆类产品功能菌剂的开发打下基础，还可作为潜在回添菌剂，应用于东北传统农家酱工厂化生产。除此之外，本文还验证了筛选菌株应用于豆浆时的酶解特性，确定菌株对豆浆的水解效果良好，为后续豆浆的营养改良提供了数据支持与理论依据，在未来也可针对蛋白、多肽、氨基酸进行更深入的研究，为豆浆的改良提供更多选择与研究方向。