沈宁辰，王觅柱

1内蒙古科技大学包头医学院研究生学院，内蒙古 包头 014030

2内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院消化科，内蒙古 包头 0140300

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率及病死率均居恶性肿瘤前列。中国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）数据显示，中国2020 年结直肠癌新发病例56 万例，病死29 万例[1]。结直肠癌的发生大多遵循“腺瘤-癌”的发病机制，在该机制下从腺瘤发展到癌一般需要5～10 年，为结直肠癌的早期发现、早期诊断、早期治疗提供了重要的窗口期[2]。因此研究结直肠癌分子标志物和治疗靶点尤为重要。特异性顶部盘状底板反应蛋白（roof plate-specific spondin，RSPO）是新兴的成年人干细胞调节因子，研究发现，RSPO 在白血病[3]、乳腺癌[4]、宫颈癌[5]、膀胱癌[6]、食管癌[7]、胃癌[8]、结直肠癌[9-10]等多种恶性肿瘤中均异常表达，在各种恶性肿瘤中发挥不同的作用。已有研究发现，RSPO3 在结直肠癌中起着促癌和抑癌两种截然相反的作用。本研究探讨RSPO3 在结直肠腺癌中的表达，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021 年6—12 月内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院收治的结直肠腺瘤和结直肠腺癌患者。纳入标准：均经病理学检查确诊为结直肠腺瘤或结直肠腺癌；既往未接受过放化疗；病历资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并其他免疫系统疾病；存在遗传性结直肠癌家族史。依据纳入和排除标准，本研究共纳入30 例结直肠腺瘤和30 例结直肠腺癌患者。结直肠腺癌患者中，男19 例，女11 例；年龄49～86 岁；分化程度：低分化4 例，中分化25 例，高分化1 例；淋巴结转移2例，无淋巴结转移28 例。结直肠腺瘤患者中，男14例，女16 例；年龄37～66 岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 蛋白质印迹法（Western blot）检测RSPO3 及β-catenin、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）的相对表达量

取30 例结直肠腺瘤组织及瘤旁5 cm 处正常组织、30 例结直肠腺癌组织及癌旁5 cm 处正常组织。研磨、裂解细胞提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度，定量定体积配置上样液。制备8%分离胶和浓缩胶，将胶板固定于电泳仪中，加入电泳液，定量定体积加入上样液，以恒定电压进行电泳，上样液在浓缩胶内使用恒压80 V，约30 min，当上样液进入分离胶后，调整为恒压120 V，约70 min，当溴酚蓝到达下胶边缘关掉电源。将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于无水甲醇中激活1 min，制作转膜“三明治”，由阴极至阳极，依次以海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵的顺序叠放，置入转膜仪中，以390 mA 的恒定电流转膜70 min。封闭并孵育一抗、二抗。将电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）液的A 液和B 液按1∶1的比例配置，现配现用，将配置好的ECL工作液滴加至膜上，孵育1 min，在暗室内进行显影，根据显影的效果，调整曝光的时间，以β-actin 为内参，计算RSPO3、BAX、β-catenin蛋白的相对表达量。

1.3 免疫组化法检测RSPO3、BAX、β-catenin 蛋白的表达情况

取30 例结直肠腺瘤组织及瘤旁5 cm 处正常组织、30 例结直肠腺癌组织及癌旁5 cm 处正常组织，固定于载玻片上，65 ℃、90 min 进行烤片，于100%二甲苯中脱蜡3 次，每次10 min，按100%、95%、85%、75%梯度乙醇水化，每次5 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3 次，每次3 min。稀释乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修复液至pH 值=8.0 进行抗原修复，高温高压修复20 min，室温下自然冷却，PBS 冲洗3 次，每次3 min。湿化盒中，滴加3%H2O2覆盖组织，室温放置10 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min。湿化盒中，滴加正常山羊血清封闭液，室温放置20 min，甩去多余液体，免冲洗。滴加一抗兔抗人RSPO3、BAX、β-catenin 单克隆抗体（稀释比例1∶100），每张切片40 μl，每种样品留片1 张，更替抗体为生理盐水40 μl（阴性对照），置于湿化盒中防止干燥，4 ℃孵育过夜，次日复温40 min，湿化盒中，滴加酶标山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3 次，每次3 min。湿化盒中滴加链霉亲和素-POD 工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 冲洗4 次，每次5 min。滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液显色，显微镜下观察显色完成后，蒸馏水冲洗终止染色，苏木素复染，流动水冲洗2 min。盐酸乙醇分化5 s，流动水冲洗2 min，氨水返蓝。75%、85%、95%、100%梯度乙醇脱水，每次5 min，二甲苯脱蜡透明5 min，盖玻片封片，显微镜下观察RSPO3、BAX、β-catenin 蛋白的表达情况。

结果判定：RSPO3、BAX 主要定位于细胞质，β-catenin 主要定位于细胞质和细胞核，呈棕黄色颗粒判定为阳性细胞。根据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分，未着色计0 分，淡黄色染色计1分，棕黄色染色计2 分，黄褐色染色计3 分；阳性细胞所占比例为0%计0分，阳性细胞所占比例为1%～33%计1 分，阳性细胞所占比例为34%～66%计2分，阳性细胞所占比例为67%～100%计3 分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相加，≤3 分判定为低表达，≥4 分判定为高表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对所有数据进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman 相关分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白相对表达量的比较

结直肠腺癌组织中RSPO3、β-catenin 的相对表达量均高于结直肠腺癌癌旁正常组织，结直肠腺瘤组织中RSPO3、β-catenin 的相对表达量均高于结直肠腺瘤瘤旁正常组织，结直肠腺癌组织中RSPO3、β-catenin 的相对表达量均高于结直肠腺瘤组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结直肠腺癌组织中BAX 的相对表达量低于结直肠腺癌癌旁正常组织，结直肠腺瘤组织中BAX 的相对表达量低于结直肠腺瘤瘤旁正常组织，结直肠腺癌组织中BAX 的相对表达量低于结直肠腺瘤组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1、表1）

表1 结直肠腺癌及癌旁正常组织、结直肠腺瘤及瘤旁正常组织中RSPO3、β-catenin、BAX 相对表达量的比较（x-x-±s）

图1 Western blot检测结直肠腺癌及癌旁正常组织、结直肠腺瘤及瘤旁正常组织中RSPO3、β-catenin、BAX 的表达情况

2.2 RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白表达情况的比较

结直肠腺癌组织、结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织中RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；结直肠腺癌组织中RSPO3、β-catenin 蛋白高表达率均高于结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织，BAX 蛋白高表达率低于结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2、图2）

表2 结直肠腺癌组织、结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白表达情况的比较[n（%）]

图2 免疫组化法检测结直肠腺癌组织、结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白的表达情况（链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶染色，×400）

2.3 结直肠腺癌组织中RSPO3 与β-catenin、BAX表达的相关性

Spearman 相关分析结果显示，结直肠腺癌组织中RSPO3 的表达与β-catenin 的表达呈正相关（r=0.936，P＜0.05），RSPO3 的表达与BAX 的表达无相关性（r=0.333，P＞0.05）。

3 讨论

RSPO 是新兴的成年人干细胞调节因子，影响干细胞的增殖与分化。RSPO 的结构域高度保守：N 末端疏水的分泌信号肽序列，两个富含半胱氨酸的furin-like 结构域，一个血小板反应蛋白结构域，C 末端带有不同电量的正电荷。RSPO 蛋白家族（RSPO1～4）在胚胎的发育过程中发挥作用，并且每种蛋白都具有独特的作用[11]。研究显示，RSPO家族蛋白主要通过WNT/β-catenin 信号通路发挥生物学效应[12]。β-catenin 是WNT 信号通路的重要调节蛋白，在WNT 信号通路激活的细胞中由细胞质进入细胞核成为转录激活因子，激活促使细胞分裂的基因。

本研究结果显示，结直肠腺癌组织中RSPO3的表达上调，且高于结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织。Spearman 相关分析结果显示，结直肠腺癌组织中RSPO3 的表达与β-catenin 的表达呈正相关（P＜0.05）。RSPO3 可通过WNT 信号通路激活下游信号因子β-catenin 的表达，促使β-catenin 由细胞质进入细胞核，激活相关的转录激活因子，启动促使细胞激活的基因。RSPO3、β-catenin 可作为结直肠腺癌侵袭和转移的标志物。本研究初步证实了RSPO3、WNT/β-catenin 信号通路可能参与了结直肠腺癌的恶性生物学行为，RSPO3 可能作为结直肠腺癌潜在的治疗靶点。

综上所述，RSPO3 在结直肠腺癌组织中高表达，可能作为结直肠腺癌临床治疗的潜在靶点。