谢银凤，王斌之*，孙大勇，安可珍，张存良，马煜，熊莉，谭金峰

(1.山东省潍坊生态环境监测中心，山东 潍坊 261041；2. 山东省生态环境监测中心，山东 济南 250101；3.北京师范大学水科学研究院，北京 100875；4. 四川省宜宾生态环境监测中心站，四川 宜宾 644000)

0 引言

随着海洋命运共同体的提出，海洋生态环境越来越受到关注[1-3]。近年来，海水养殖业迅速发展，大量养殖废水的排放对海洋生态环境造成了压力。氨氮是养殖废水的主要污染物[4-6]，对海洋环境和水生生物有严重影响，对其进行准确高效的监测尤为必要。

氨氮是指水体中以离子铵(NH4+)和游离氨(NH3)形式存在的氮。海水氨氮的监测方法主要有次溴酸钠氧化法、靛酚蓝分光光度法、气相分子吸收法和流动注射法等[7-10]。气相分子吸收和流动注射法仪器昂贵，成本高，不便于方法的普及；靛酚蓝法所用试剂对环境不友好且分析时间过长。次溴酸钠法不使用剧毒物质，准确度高，分析时间也较靛酚蓝法短，因此是国控网海水水质监测的优选方法。

国内已有部分学者从不同的角度对海水氨氮次溴酸钠法进行了研究。吕晓洁等[7]从实验用水、次溴酸钠和磺胺的加入速度、杂质干扰等方面进行了研究，明确了氨氮分析的注意事项。任妍冰等[11]对海水氨氮试验条件进行了优化，考察了温度、氧化时间、次溴酸盐用量和氨基酸等因素的影响。张健等[12]对次溴酸钠法进行了改良，通过将显色剂和氧化剂浓度扩大到原来的5倍，明显提高了方法测定上限，特别适合氨氮浓度高于0.3 mg/L水样的分析。但在对低浓度含氨废水(小于0.3 mg/L)的测量上，改良法不如国标法GB 17378.4—2007《海洋监测规范》准确[13]。而小于0.3 mg/L浓度的海水，超出了国标法的校准曲线范围，需稀释后才可测定。这一方面延长了分析时间，另一方面氨的水溶性较强，分析时间的加长也会导致空气中的氨部分溶入样品中，影响分析结果。王文雷[14]在纳氏试剂比色法测定水体中氨氮的研究中，对自配标液进行“比色前稀释”和“比色后稀释”比对，指出在一定浓度范围内“比色后稀释”与“比色前稀释”差别不大。

本文在前人工作的基础上，采用次溴酸钠氧化法，分别对实验用水、不同光程比色皿的灵敏度响应进行了比对，并针对海水低浓度氨氮样品(0.1～0.3 mg/L)开展了显色前和显色后稀释研究。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

T6新悦可见分光光度计、10 mm、20 mm和30 mm玻璃比色皿，100 mL比色管，MiliQ超纯水机。其他实验室常用器具。

1.2 试剂和溶液配制

标准物质：离子色谱用铵离子溶液标准物质GBW(E)083341(北京坛墨质检科技有限公司)。试剂：氢氧化钠，三氯甲烷，盐酸，溴酸钾，溴化钾，磺胺，盐酸萘乙二胺。所用试剂均按GB 17378.4—2007 《海洋监测规范》配制[13]，具体如下：

(1)氢氧化钠溶液(400 g/L)：称取200 g氢氧化钠溶于1000 mL水中，加热蒸发至500 mL，盛于聚乙烯瓶中。

(2)溴酸钾一溴化钾贮备液：称取2.8 g溴酸钾和20.0 g溴化钾溶于1000 mL水中，贮存于棕色试剂瓶中4 ℃冷藏保存。

(3)次溴酸钠溶液：量取溴酸钾一溴化钾贮备溶液1.0 mL于250 mL聚乙烯瓶中，加入49 mL水和3.0 mL 50%盐酸溶液，盖紧摇匀，置于暗处5 min后加入50 mL氢氧化钠溶液，混匀。临用前配制。

(4)对氨基苯磺酰胺溶液(2.0 g/L)：称取2.0 g磺胺，溶于1000 mL 50%盐酸溶液中，贮存于棕色试剂瓶中，4 ℃冷藏保存。有效期为2个月。

(5)盐酸萘乙二胺溶液：称取0.50 g盐酸萘乙二胺，溶于500 mL水中，贮于棕色试剂瓶中，4 ℃冷藏保存。有效期为1个月。

(6)铵标准贮备液(以N计，77.8 mg/L)：移取10.00 mL 778 mg/L(以N计)离子色谱用铵离子溶液标准物质于100 mL容量瓶中，加100 µL三氯甲烷后用水定容至刻线，混匀后贮存于棕色试剂瓶中，4 ℃冷藏保存。有效期为半年。

(7)铵标准使用液(以N计，7.78 mg/L)：移取10.00 mL氨标准溶液贮备液于100 mL容量瓶中，加水定容，混匀，临用现配。

2 实验方法

2.1 实验用水对比

实验用水选用MiliQ新制超纯水和新制蒸馏水，分别测定试剂空白和实验用水空白，各分析三个平行样。

具体步骤如下：试剂空白—量取5 mL新配制的次溴酸钠溶液于100 mL比色管中，立即加入5 mL磺胺溶液，混匀。放置5 min后加50 mL MiliQ新制超纯水和新制蒸馏水，然后加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，混匀，15 min后用3 cm比色皿测定空白吸光度。

实验用水空白—分别移取50.0 mL MiliQ新制超纯水和新制蒸馏水于100 mL比色管中，各加入5 mL次溴酸钠溶液，混匀，放置30 min。各加入5 mL磺胺溶液，混匀，放置5 min。各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，混匀，15 min后用3 cm比色皿上机测定。

2.2 标准曲线绘制和比色皿的选择

铵标准使用液(以N计)：7.78 mg/L。取6个200 mL容量瓶，分别加入0、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL铵标准使用液，加水定容至刻线，混匀。标准溶液浓度依次为：0、0.00778、0.0156、0.0311、0.0467、0.0622 mg/L。按2.1实验用水空白分析步骤依次加入试剂，用1 cm、2 cm和3 cm比色皿分别上机测定。每个标准点均做三个平行样。

2.3 样品测定

主要针对0.1～0.3 mg/L的自配制氨氮标准溶液和养殖海水实际样品。分别采用显色前和显色后稀释两种方式处理，具体操作为：比色前处理是将待测样品稀释至相应倍数，取50 mL稀释后样品于比色管中，参照2.1实验用水空白分析步骤依次加入试剂反应，用3 cm比色皿上机测定。比色后是移取50 mL待测原样于比色管中，参照2.1实验用水空白流程依次加入试剂，显色反应完成后将溶液稀释至相应倍数，用3 cm比色皿上机分析。所有样品均平行分析三次。

2.4 方法检出限测定

方法检出限按照HJ 168—2010 《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》附录A中检出限的测定方法进行[15]，即按样品分析的全部步骤，对实验室空白样品进行十一次测定，计算十一次测定的标准偏差，按附录A中公式计算方法检出限。实验室空白样品分析流程参照2.1实验用水空白步骤进行。

3 结果与讨论

3.1 实验用水

国标法要求实验用水使用无氨蒸馏水或等效水。制取无氨蒸馏水步骤繁琐，且蒸馏时空气中氨也极易溶入制备水中，有时可导致蒸馏空白偏高。实验选用MiliQ新制超纯水与新制蒸馏水进行了对比(表1)，结果证明两种水无差别，因此在做海水氨氮分析时可考虑用MiliQ新制超纯水替代新制蒸馏水，简化实验流程，提高效率。

表1 实验用水吸光度

3.2 标准曲线绘制和比色皿的选择

国标方法推荐选用5 cm比色皿，但在实际工作中，采用5 cm比色皿测定有时会有超出仪器最佳吸光度范围，导致线性不好、最高点上不去等问题。而采用太小光程比色皿会导致低浓度样品吸光度太低而无法准确定量。实验对比了不同光程比色皿对自配制标准溶液的响应值(表2)，从1 cm到3 cm光程，斜率呈线性变化，1 cm曲线线性差，不到三个九。2 cm和3 cm线性均达三个九以上，然光程越长，灵敏度越高，最终选定3 cm比色皿作为吸收池。

表2 不同光程比色皿对标准溶液的响应

3.3 样品测定

3.3.1 自配制标准溶液测定

次溴酸盐氧化法测定氨氮的原理是在碱性条件下将海水中的氨氧化为亚硝酸盐，反应方程式：

在酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺发生重氮化反应，反应方程式：

生成的重氮盐再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色偶氮染料，反应方程式：

其颜色与样液中亚硝酸盐含量成正比测定，扣除原有亚硝酸盐氮的浓度，即得氨氮浓度。

在王文雷研究[14]的基础上，本实验采用显色前和显色后两种稀释方式对比，探索出了一种高效准确的海水氨氮低浓度(小于0.3 mg/L)样品分析方法。显色后稀释，一方面MiliQ纯水中氨氮、亚硝酸盐氮含量比较低，几乎可忽略不计；另一方面，即使存在少量的氨氮和亚硝酸盐氮，所有化学反应已进行完全，稀释过程只是用实验空白水处理，并未引入其他试剂，再无条件进行相应化学反应。因此，整个稀释过程只是反应液颜色呈倍数的变浅，即吸光度相应减小，故在一定浓度范围内显色后稀释和显色前稀释分析结果应差别不大。

实验配制了浓度为标准溶液1(0.124 mg/L)、标准溶液2(0.249 mg/L)、标准溶液3(0.311 mg/L)、标准溶液4(0.389 mg/L)、标准溶液5(0.778 mg/L)氨氮标准溶液，参照2.1实验用水空白步骤进行，测定结果见图1、表3。结果显示：当标准溶液浓度低于0.311 mg/L时，显色前和显色后稀释相对误差和相对标准偏差均在允许范围内，两种处理方式基本无差别。而0.389 mg/L和0.778 mg/L的样品，从图1和表3可明显看出，显色前稀释和显色后稀释相对偏差增大，显色前稀释标准溶液浓度相对误差较小，满足要求，而显色后稀释测定结果偏小，相对误差不在范围内。显色后稀释测定结果偏小的原因，可能是氧化剂或显色剂等试剂含量不足，不能使高浓度样品中的氨完全反应。因此，暂定显色后稀释对象为0.1～0.3 mg/L浓度的样品。

图1 显色前后稀释结果对比

表3 标准样品的测定

3.3.2 实际样品测定

为验证显色后稀释对实际样品的分析结果，实验对养殖海水样品进行了测定，分析结果见表4。综合标准溶液和实际样品结果可以看出，显色前稀释和显色后稀释差别不大，相对标准偏差在范围内。

表4 养殖海水样品的测定

3.4 检出限的测定

检出限的测定按HJ 168—2010 《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》[15]附录A中方法进行，即按参照2.1实验用水空白步骤分析步骤，对实验室空白样品进行十一次测定，计算其标准偏差，检出限按MDL=t(n-1,0.99)×S计算，结果见表5。

表5 检出限的测定

4 结论

本实验采用次溴酸钠氧化法，分别对实验用水、不同光程比色皿的灵敏度响应进行了比对，并针对海水低浓度氨氮样品开展了显色前和显色后对比分析。研究证明：

(1) MiliQ新制超纯水可替代新制蒸馏水作为实验用水，其他厂家新制超纯水若满足要求也可替代蒸馏水，简化实验过程。

(2)依据灵敏度和标准曲线线性，选定3 cm比色皿作为吸收池。

(3)通过显色前和显色后两种稀释方式的对比，发现样品浓度≤0.3 mg/L左右两种稀释方式无差别，样品浓度大于0.3 mg/L左右时，显色后稀释可能因为氧化剂或显色剂含量不足，样品中氨氮不能完全氧化或者显色，浓度较显色前稀释偏低。因此，显色后稀释适用于0.1～0.3 mg/L的海水低浓度氨氮样品，有效缩短了分析时间。