张国翠，王建，劳海黎，张盟，孟庆捷

微阵列芯片技术在耐多药结核病临床诊断中的应用研究

张国翠，王建，劳海黎，张盟，孟庆捷

滨州市中心医院检验科，山东滨州 251700

探讨微阵列芯片技术在耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）临床诊断中的应用。收集2020年6月至2021年5月经滨州市中心医院确诊的245例住院肺结核患者的标本（痰液标本125例和痰培养分离菌株120例）。痰液标本同时采用DNA微阵列芯片技术和传统培养法检测其结核杆菌阳性率。痰液标本和分离菌株均采用DNA微阵列芯片技术进行肺结核耐多药检测和分枝杆菌菌种鉴定。125例痰液标本经DNA微阵列芯片技术和痰培养法检测，阳性率分别为58.4%（73/125）和24.8%（31/125），两种方法比较差异有统计学意义（2=14.520，<0.001）。采用DNA微阵列芯片技术检测125例痰液标本和120例分离菌株，共检出结核分枝杆菌复合群192例，非结核分枝杆菌7例。结核分枝杆菌复合群192例检出耐药者41例，其中耐异烟肼15例，耐利福平19例，同时耐两种药物7例。非结核分枝杆菌包括胞内分枝杆菌4例，堪萨斯分枝杆菌2例，鸟分枝杆菌1例。DNA微阵列芯片技术检测周期短，能同时进行结核分枝杆菌耐多药检测和菌种鉴定，对MDR-TB的早期诊断和治疗有较大的临床应用价值。

肺结核；非结核分枝杆菌；耐多药肺结核病；异烟肼；利福平

世界卫生组织报道的全球每年新发耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）患者37.8万例，中国的新发病例数约11万[1-3]。我国结核病控制的总体形势仍然严峻，耐药结核病尤其是MDR-TB是目前结核病防治的重点和难点。MDR-TB引起的高发病率及高病死率在结核病控制中引起更多的关注[2-4]。传统耐多药检测方法耗时且敏感度较低，无法满足临床需求，本研究利用DNA微阵列芯片技术快速诊断和鉴别诊断肺结核及其耐药情况，为临床早期诊断治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集2020年6月至2021年5月经滨州市中心医院确诊的245例住院肺结核患者的标本（痰液标本125例和痰培养分离菌株120例）。纳入标准：符合《肺结核诊断 WS 288—2017》中诊断标准；有肺结核典型临床症状；经影像学检查，肺部有活动性肺结核病变。排除标准：合并其他肺部疾病；精神异常患者。纳入患者中男127例，女118例，年龄18～76岁，平均年龄46.9岁。所有患者均签署知情同意书，本研究经滨州市中心医院内部伦理委员会批准（伦理审批号：2020005）。

1.2 试剂和仪器

晶芯®结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）和晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）购自博奥生物技术有限公司。使用仪器有ABI500荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪；晶芯®E-Cycler™96 PCR仪；晶芯®BioMixer™Ⅱ芯片杂交仪；晶芯®SlideWasher™芯片洗干仪；晶芯®LuxScan™10K/B微阵列芯片扫描仪等。

1.3 方法

125份合格痰液标本取半量（约2.5ml）加入两倍体积4%NaOH溶液，震荡15min，取0.1ml液化痰液接种酸性罗氏培养基中，37℃孵育，4周报告结果，操作按《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[5]要求；剩余半量（约2.5ml）痰液标本加入两倍体积4%NaOH溶液，反复震荡后静置30min，取1ml液化痰液加入1.5ml离心管中，高速离心（14 000转/min）10min，弃上清，加1ml生理盐水于沉淀中离心（15 000转/min）10min，弃上清，再加50µl核酸提取液于沉淀中，充分震荡，100℃金属浴10min，离心（15 000转/min）5min，取其上清作为反应模板，然后进行PCR扩增、芯片杂交和扫描判读。

120例患者支气管肺泡灌洗液经BACTEC MGIT 960培养报告阳性的分离菌株，用取菌环直接挑取单个菌落加入80µl核酸提取液中，置100℃金属浴10min，离心5min，取上清。所得核酸进行PCR扩增、芯片杂交和扫描判读。结核分枝杆菌耐多药检测和分枝杆菌菌种鉴定实验严格按《结核病实验室标准化操作与网络建设》[6]基因芯片法标准操作规程进行。

1.4 质量控制

每个标本进行耐药检测时，芯片内部设有内部质控。一个分枝杆菌属质控，一个结核分枝杆菌质控，2个芯片制备质控，2个芯片杂交质控，一个空白对照质控，一个阴性对照质控，以及靶基因ropB、KatG和inhA扩增质控。如果其中任何一个质控结果错误，则标本结果定位无效，需要进行复检；每个标本进行实时荧光定量PCR检测时设有空白对照质控、阴性对照质控、阳性对照质控、四个浓度的标准曲线。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两种方法检测痰液的结核杆菌阳性率比较

125份痰液标本采用DNA微阵列芯片技术和痰培养法检测，DNA微阵列芯片技术检出阳性73例（58.4%），痰培养法检出阳性31例（24.8%），两种方法检出阳性结果比较差异有统计学意义（2=14.520，<0.001）。

2.2 125例痰液和120例分离菌株的菌种鉴定情况

采用DNA微阵列芯片技术检测125例痰液和120例分离菌株，共检出结核分枝杆菌复合群192例（痰液73例，分离菌株119例），非结核分枝杆菌7例（痰液6例，分离菌株1例）。7例非结核分枝杆菌包括胞内分枝杆菌4株，堪萨斯分枝杆菌2株，鸟分枝杆菌1株。

2.3 192例结核分枝杆菌复合群耐多药检测情况

DNA微阵列芯片技术检测结核分枝杆菌复合群192例，检出野生型151例，耐药者41例，总耐药率21.4%；其中，检出耐异烟肼（isoniazid，INH）单药者15例（7.8%），耐利福平（rifampicin，RIF）单药者19例（9.9%）；同时耐INH和RIF者7例（3.6%），其基因型分布见表1。

3 讨论

MDR-TB是指同时对包括INH和RIF两种或两种以上抗结核药物发生耐药的结核分枝杆菌所致的结核病。传统MDR-TB的表型诊断方法主要有绝对浓度法和比例法，上述两种方法必须在获得菌株的基础上进行药敏试验，耗时较长且培养的敏感度较低，导致部分患者漏诊或不能及时被检出。DNA微阵列芯片技术在固相载体上很小面积内包被多达千万个核酸分子，组成微点阵列，在一定条件下载体上的核酸分子可与来自标本互补的核酸片段杂交，然后把标本中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上可检测到杂交信号，敏感度和特异性较高。DNA微阵列芯片技术操作仅需两步，即扩增和杂交，可将检测时间由传统方法的2～3个月缩短到6h左右，检测RIF和INH耐药情况的同时还能完成菌种鉴定分型。

表1 耐药结核杆菌DNA微阵列芯片法检测结果

研究显示，采用DNA微阵列芯片技术检测的INH和RIF总耐药率为17.81%～27.5%，耐多药率为6.85%，INH和RIF单耐药率分别为13.3%、7.5%[1-4]。本研究DNA微阵列芯片技术共检测245例患者，结核分枝杆菌检出率78.4%，总耐药率21.4%，INH、RIF耐药率分别7.8%和9.9%，耐多药率3.6%。本研究结果显示，41例耐药者基因突变位点前两位的是katG315（G→C）突变型、rpoB531（C→T）突变型，其突变发生率分别为36.6%（15/41）和39.0%（16/41），与相关研究有所差异[7]。

国内报道，临床分离株药物作用靶基因发生突变是结核分枝杆菌产生耐药的主要分子机制，现已发现96%耐RIF菌株的rpoB基因中一个81bp区域出现点突变；耐INH菌株中约70%与katG基因突变有关，20%～35%与inhA基因调节区突变有关，katG/inhA位点总突变率为35.1%（33/94）[8-10]。

非结核分枝杆菌感染有逐年升高趋势，由1984年的4.2%升至2010年的22.9%[9]。山东省2625株分离菌株检出36株非结核分枝杆菌，占1.4%，其中29株为胞内分枝杆菌（80.6%）[10]。北京市721株分离菌株检出非结核分枝杆菌93株（12.9%），以脓肿分枝杆菌占首位[11]。上海市877株分离菌株PCR快速鉴定法检出非结核分枝杆菌96株（10.9%）[12]。本研究结果中，非结核分枝杆菌占比2.9%（7/245），胞内分枝杆菌居首位，其次为堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌。提示我国非结核分枝杆菌发病率有一定差异，可能与患者所在区域、生活环境和生活习性有关。

综上所述，DNA微阵列芯片技术检测周期短，操作简单，能同时进行结核分枝杆菌耐多药检测和菌种鉴定，对MDR-TB的早期诊断和治疗有较大的临床应用价值。

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Application of microarray chip technology in clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis

Department of Clinical Laboratory, Binzhou Central Hospital, Binzhou 251700, Shandong, China

To explore the application of microarray chip technology in the clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB).Samples (125 sputum specimens and 120 strains isolated from sputum culture) were collected from 245 patients diagnosed with pulmonary tuberculosis in Binzhou Central Hospital from June 2020 to May 2021. Sputum samples were tested by DNA microarray chip technology and traditional culture method. DNA microarray chip technology was used to detect multidrug resistance and identify mycobacterium strains in sputum samples and isolated strains.The positive rates of 125 sputum samples were 58.4% (73/125) and 24.8% (31/125) by DNA microarray chip technology and sputum culture, respectively, and the difference between the two methods was statistically significant (2=14.520,<0.001). Using DNA microarray chip technology, 125 sputum samples and 120 isolated strains were detected. A total of 192 mycobacterium tuberculosis complex and 7 nontuberculous mycobacteria were detected. Among 192 cases of mycobacterium tuberculosis complex, 41 cases were drug resistant, including 15 cases resistant to isoniazid, 19 cases resistant to rifampicin and 7 cases resistant to both drugs. Nontuberculous mycobacteria included 4 cases Mycobacterium intracellulare, 2 case Mycobacterium kansasii and 1 case Mycobacterium avium.DNA microarray chip technology has a short detection cycle, can be used to detect multidrug resistance and strain identification of mycobacterium tuberculosis at the same time, and has great clinical application value for early diagnosis and treatment of MDR-TB.

Tuberculosis; Nontuberculous mycobacteria; Multidrug resistant tuberculosis; Isoniazid; Rifampicin

R372

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.018

张国翠，电子信箱：15215437913@163.com

（2023–01–15）

（2023–07–18）