李巧云,郭振峰,郝晓鹏,唐建卫,高 艳,殷贵鸿

(河南农业大学农学院/国家小麦工程技术研究中心/河南省小麦技术创新中心,河南郑州 450046)

1 小麦茎基腐病的危害

小麦(Triticumaestivum)茎基腐病(crown rot)是由镰刀菌属(Fusariumspp.)的多种真菌复合侵染引起,从种子萌发到成熟期皆可发病[1]。在萌发期,病原菌抑制胚芽鞘伸长,降低出苗率,严重时可导致种子腐烂或幼苗枯萎[2];在苗期,受侵染的植株茎基部褐(黑)变并不断向上侵染芽鞘、叶鞘和主茎,严重时整株死亡[3-4];拔节后,该病害可引起茎秆褐变坏死[5-6],出现枯白穗并导致减产[7]。另外,被茎基腐病病原菌侵染的植株及籽粒中还会残留多种真菌毒素,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、玉米赤酶烯酮(zearalenone,ZEN)等,这些毒素可损伤植株,同时影响其加工食品及饲料的安全性,严重危害人畜生命健康[8]。

小麦茎基腐病自上世纪50年代在澳大利亚被报道以来[9],在中国[10]、美国[7,11]、加拿大[12]、澳大利亚[13]、阿根廷[14]等多个国家被发现,成为一种世界性的重要病害,对小麦生产造成严重威胁。如在澳大利亚,该病害造成小麦年均减产约10%,部分人工接种地区产量损失高达85%[13],直接经济损失每年约7 900万澳元[15];在美国西北部地区该病发生率高达76%[11],年均减产 9.5%,严重年份可达35.0%,每公顷直接经济损失219美元[5,7]。陈厚德等[16]在1996年首次报道了江苏省的小麦茎基腐病,随后在河南[4,17]、河北[18-20]、山东[21]、陕西[22]等地陆续也有报道。近年来,小麦茎基腐病在中国不同麦区频繁发生,尤其在黄淮麦区,呈现出不断蔓延和加重的趋势[23-24],如河北省2013年很少见到由茎基腐病引起的小麦白穗,但2015年普遍发生,严重地块白穗率达到20%～50%[20];山东省2016年小麦茎基腐病发病率为10%～30%[21],2020年该省发生面积突破80万hm2,遍布15市123个县(市)[25];河南省2013、2015和2016年小麦茎基腐病病田白穗率分别为0.4%～11%、0.1%～16.1%和 0.1%～31.5%[26],2019年该省部分田块发病率高达78.9%[27]。

小麦对茎基腐病的抗性由多基因控制[3],病原菌宿主广泛,在田间残留秸秆上可生存数年、遇适宜环境可再次引发病害[28],加上其发病部位在茎基部,且全生育期均可发病,使该病害的防控比较困难。种植抗病品种是应对茎基腐病最经济有效的措施,然而,国内外至今未发现对茎基腐病免疫的小麦品种,高抗和中抗品种也很少[4,29-31]。如Wildermuth等[29]鉴定了400 份小麦材料的成株期茎基腐病抗性,发现只有Gluyas Early、Mexico234和Reliance表现为中抗;张 鹏等[23]对82份小麦种质进行苗期茎基腐病抗性鉴定,发现红蚰子、翻山小麦等13份材料达到中抗水平(15.8%);杨 云等[4]等对88份黄淮麦区主推小麦品种进行抗性鉴定,发现所有品种在苗期均表现为感病,而在成株期能达到中抗水平的只有中育8号、周麦27号等10份材料(11.4%),阳 霞[32]对1 306 份小麦材料进行苗期鉴定,发现80%的材料表现为高感。可见,提高茎基腐病抗性是今后小麦遗传育种工作的主要目标之一。

2 目前常用的小麦茎基腐病抗性鉴定方法

准确的表型鉴定是进行小麦抗病育种的基础,目前,小麦茎基腐病的鉴定方法主要包括苗期和成株期抗性鉴定两个方面,其中,苗期抗性鉴定的方法比较多,主要有土培苗接种法和水培苗接种法;成株期抗性鉴定分别在温室与大田进行。对不同方法分类概述如下:

2.1 苗期茎基腐病抗性鉴定

2.1.1 苗期水培苗的接种鉴定

根据接种方式,又分为孢子液浸泡法、套菌碟法、小烧杯法、水培苗棉球绕茎法、培养皿直接加孢子液法、植株滴加孢子液法等多种,其中孢子液浸泡法和棉球绕茎法也用于土培苗的接种。

孢子液浸泡法由Yang等[33]于2010年建立,是将萌发2 d(胚芽鞘长约0.5 cm)的种子浸泡在孢子悬浮液中1～2 min后,置于湿纸巾中或格子纸上,14或21 d后进行调查[33-34]。套菌碟法由张向向等[18]于2014年建立,是将长有致病菌的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基用打孔器取菌碟,套在萌发种子的芽底部,然后用湿布包裹或置于培养皿中,5～20 d后进行调查[18,24]。小烧杯法由郭炜等[35]于2018年建立,是将菌碟放在有琼脂水培养基的烧杯中央,然后将萌发种子绕菌碟插入培养基中,5 d后进行调查。此外,还有水培苗棉球绕茎法、培养皿直接加孢子液法[3]和滴加孢子液接种法[24]。水培苗棉球绕茎法是在幼苗茎基部缠绕医用棉球,在棉球内侧苗茎部接触处接种孢子液并固定于水培盒中,10 d后调查病情[3];培养皿直接加孢子液法是将孢子液加在培养幼苗的培养皿中,10 d后调查病情[3]。滴加孢子液接种法是指在幼苗的胚芽和种子的夹角处滴加孢子液接种,5 d后调查病情[24]。

小烧杯法、套菌碟法最利于发病[24,34],但是操作起来比较麻烦,不适用于大群体的鉴定;滴加孢子液与水培苗棉球绕茎法发病较慢[3,24]、操作起来又比较麻烦,限制了其应用;孢子液浸泡法接种虽然致病性不如套菌碟法高,但适当延长培养时间,也能达到良好的致病效果[24],且其操作相对简单,较适合于大批量材料的抗性鉴定[34],是目前使用较多的水培苗鉴定方法[24,33-34]。

苗期水培法一般根据苗褐变的程度,采用由Li等[36]基于Wildermuth等[37]的研究基础上建立的0～5级记录方法,记录标准为:0级,无明显褐变症状;1级,胚芽鞘或第一叶鞘上有明显褐变症状;2级,第1叶鞘和冠间(below subcrown internode)部分坏死;3级,第二叶鞘和冠间部分或完全坏死,苗高降低(≤1/2);4级,第三叶鞘或叶片和冠间部分或完全坏死,苗高降低(>1/2);5级,整株死亡。Yang等[33]、程 睿等[34]研究均采用了此记录标准。多数学者也对该记录标准进行了调整,采用0～4级[35]、0～7级[18]或调整的0～5级法[3],也有记录时根据根系褐变情况进行记录[35,38]。在记录病情的基础上计算病情指数进行抗性评价。病情指数(DI)=∑[(级数×各级株数)/(最高级数×总株数)]×100,其中,DI=0时为免疫(I),DI=0～10.0时为高抗(HR),DI=10.1～20.0时为中抗(HR),DI=20.1～30.0时为中感(MS),DI>30.1时为高感(HS),这是目前使用较多的评价标准[3-4,35]。

2.1.2 苗期土培苗的接种鉴定

苗期土培苗接种方法主要有棉球(布)绕茎法、茎基部滴注法、天然培养基接种法、孢子液浸染法等。

棉球(布)绕茎法由Akinsanmi等[38]于2004年建立,在苗茎基部0.5～1.0 cm处用脱脂棉或棉布缠绕,将孢子悬浮液注入棉球(布)中,35 d后调查;Mitter等[15]也用该方法对致病菌毒性进行测定。茎基部滴注法由Mitter等[5]于2006年建立,在出苗后10 d,在茎基部0.5 cm处滴注10 μL孢子悬浮液,35 d 后调查,张 鹏等[23]、赵 凯等[31]、冀春雨[39]等均用该方法进行了种质资源的抗性鉴定,Li等[40]也利用此方法进行了抗病QTL的定位。天然培养基接种法的天然培养基为致病菌侵染后的小麦粒[41-42]、小米粒[4,43-44]、小麦大麦粒1:1混合后的粉碎物[37]或麦糠[45]等;接种方式可以是将病谷粒与灭菌土混合(菌土)后将种子播于其中[4,19],或按“播种-覆土-放病谷粒-覆土”的顺序接种[17],或在萌发种子上方铺一层病谷粒后覆土[32,37],或出苗后将病谷粒放在苗根部一侧[42],一般在接种后22～45 d调查,以28 d或35 d较多[17,30,40-41]。孢子液浸泡法由Li等[36]于2008年建立,接种方法同水培苗,在抗茎基腐病QTL定位研究中应用较多[46-47],一般在接种后35 d或 45 d调查[36,46]。

苗期土培苗的不同接种方法中,天然培养基接种法茎基腐发病明显,能很好区分品种抗性[37],且操作简单、重复性好(病情指数在重复间相关性高),可大批量鉴定材料[32,44,46],是苗期抗性鉴定的首选方法。不过,其鉴定结果与成株期鉴定有一定的差异,而且需要的时间长[4];另外,该方法与品种间存在显著的互作效应,可能导致抗病品种出现比感病品种更严重的症状[44,48]。棉球接种法也具有结果稳定、品种间差异明显的特点,但操作麻烦,且鉴定周期也比较长[3]。孢子液浸泡法的发病程度高于茎基部滴注法、能区分抗、感品种,且发病等级与田间鉴定结果一致,稳定可靠、重复性好,可实现高通量、大规模的鉴定[49],不过该方法可能导致较高的死苗率[34,36,44]。茎基部滴注法也能较好的鉴定品种抗性、鉴定结果与成株期抗性结果较为一致[5,39,44],但是比较繁琐、试验误差较大(变异系数50%～78%)[43]。通过以上分析可知,不同接种方法均能区分抗、感品系,但从便于操作、高通量的角度考虑,天然培养基接种法和孢子液浸泡法相对较好,目前应用最广泛的是病小米粒/小麦粒天然培养基接种法[32,42,46]。

苗期土培苗鉴定结果记录方法较多,常用的有3种:茎基腐症状分级(crown rot score)[7,19,31,46 ]、严重度指数(crown rot severity index)[5,39]和叶鞘症状得分和(leaf sheath sum)[37],其中以茎基腐症状分级法使用最广泛、叶鞘症状得分和使用较少,严重度指数主要用于茎基部滴注法[39,44]。茎基腐症状分级的方法较多,其中由Li等[36]建立的0～5级法(同2.1.1水培苗接种鉴定记录方法)最常用。一些学者对0～5级标准稍有修改[23,29-31],另外还有0～6级法[42]、0～7级法[7]、0～8级法[30,41]、0～9级法[4,19,32]以及0～10级法[46,49]等。在记录茎基腐症状基础上计算病情指数,病情指数计算及抗性评价标准同2.1.1。严重度指数(I) =(主茎褐变长度/苗长)×褐变叶鞘的层数,该值一般在0～3之间[5,39,43]。然后依据严重度指数进行抗性评价,即免疫(I=0)、高抗(I≤0.050)、抗(I = 0.051～0.100)、中抗(I=0.101～0.150)、中感(I= 0.151～0.200)、感(I=0.201～0.250)、高感(I= 0.250)[39]。叶鞘症状得分和是按照0～4级标准对第1～3片叶鞘进行调查,然后将3片叶的得分相加(最高总分为12分),其标准为:0级,叶鞘完全健康;1级,叶鞘褐变<25%;2级,叶鞘褐变为25%～50%;3级,叶鞘褐变为51%～75%;4级,叶鞘褐变>75%[37]。

2.2 成株期茎基腐病抗性鉴定

2.2.1 成株期温室鉴定

进行成株期温室鉴定的研究不多,一般采用天然培养基接种法,将种子播于盆中,覆盖约2 cm的土,然后将病谷粒撒在种子上方再覆土[7]或者在拔节时将病麦粒放在小麦茎基部[42],于灌浆期调查。

成株期温室鉴定结果采用0～7级法记载,具体为:0级,无症状;1级,盾片节(scutellar node)褐变;2级,盾片节、冠节或叶鞘褐变;3级,盾片节、冠节或叶鞘褐变严重、植株不死;4级,节间、叶鞘和下部茎秆褐变、植株有死亡症状;5级,茎秆腐烂、植株濒临死亡;6级,茎秆腐烂、植株(有3片以上叶子)死亡;7级,因种子腐烂或幼苗腐烂而致植物死亡[7]。也有0～4级法记载,具体为:0级,无症状;1级,地上第一茎节出现褐变,但没到第二茎节;2级,第一茎节完全褐变,并扩展到第二茎节;3级,褐变扩展到第三茎节及以上,部分出现白穗现象,植株接近死亡或已经死亡;4级,植株不抽穗,黄化死亡[4,42]。

2.2.2 成株期大田鉴定

成株期大田鉴定一般也采用天然培养基接种法,Wallwork等[45]建立了Terrace method,即将塑料管 (10 cm×5 cm)填土至1/2处,放好种子并盖土至3/4处,剩下1/4填满病麦糠与土的混合物,将塑料管放在钢板箱中埋到大田中,该方法避免了田间杂菌污染、接种不均匀等问题,但是无法区分有部分抗性的硬粒小麦。也有不少学者采用人工开沟、将病谷粒或其粉碎物均匀撒到沟里再播种[7,37],或先将病米粒与表层土混匀再开沟播种[4],或以发病严重地块为自然病圃进行鉴定[30]。由于受接种量差异、杂菌侵染、气候以及环境条件等因素的不同,大田鉴定结果的重复性较差[4,45,48]。

成株期抗性鉴定一般分两次调查,第一次在出苗21～35 d时,调查一定面积的出苗数和死苗(明显黄化或干枯死亡)数、以及茎基腐症状分级(记载方法基本同苗期标准)[7,17];成熟期时记载病蘖数和白穗数,计算病蘖率指数(品种病蘖率/高感对照品种的病蘖率)和白穗率[4,37]、以及小区产量[5,7,28],另外还按照0～4级标准记载主茎症状[4,17,42],病情指数计算与抗性评价标准同苗期。可见,成株期的记录既考虑了茎秆褐变的严重程度,也考虑了白穗率和产量变化。

2.3 苗期与成株期抗性鉴定方法比较

2.3.1 苗期抗性鉴定的优势与不足

相对于成株期鉴定来说,苗期鉴定具有明显的优势,具体表现如下:(一)结果稳定:与大田环境相比,温室中的温度、湿度、光照等条件易控制,多次鉴定结果的相关性较高、重现性好[37,45]。(二)节省空间:苗期鉴定尤其是水培苗的接种鉴定在培养皿或湿纸巾中进行,无需用培养基质,占用空间少。(三)节省时间:天然培养基接种试验周期一般30～45 d,湿纸巾法7～14 d,而菌碟接种法在最优条件下仅为5 d。(四)可随时进行:苗期鉴定不受小麦生育期限制,可以随时进行,一年内可以进行多次鉴定。基于这些优势,目前小麦茎基腐病抗性鉴定大都采用苗期温室鉴定方法。

但是苗期鉴定也有明显的不足,与大田鉴定结果相比,苗期鉴定结果发病情况更加严重。原因可能是温室的温度、湿度等条件均适宜病菌侵染与病害发展,加上温室的幼苗生长快、长势较弱,导致植株易感病且发病较重,只有抗病性好的种质才能被鉴定出来,而抗病性较弱的种质不能被鉴定到,这就容易忽视育种中有价值的中抗或中感种质[45],其鉴定结果也与田间自然条件下发病情况存在一定的差异[41]。

2.3.2 成株期抗性鉴定的必要性与不利条件

尽管苗期鉴定应用广泛,田间的多年鉴定也是必要的[41]。主要原因是茎基腐病病原菌的侵染并不局限于某个特殊的时期、在整个生育期内均可发生[6]。苗期受侵染在成株期的表型与成株期才受到侵染的表型是否一致尚不明确[41],所以成株期鉴定是非常必要的。然而成株期鉴定尤其是大田鉴定往往受诸多不利因素的限制。(1) 重复性差:诸多环境条件如土壤类型、栽培措施、气象因子等都会影响发病程度[37,45],还有其他致病菌如小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、全蚀病菌(Gauemannomycesgraminis)、纹枯病菌(Rhizoctoniacerealia)等的污染与互作也影响茎基腐病的发生发展,特别是气象因子在不同年点间存在较大差异,所以,基于大田的鉴定结果往往不稳定[5],因此基于大田表型的抗茎基腐病QTL定位结果报道较少。(2) 周期长:茎基腐病成株期抗性鉴定一年只能进行一次,而且需要较大的面积[4,17],对大量材料的鉴定存在一定的困难。(3) 发病程度不充分:大田环境特别是气象条件如果不适宜病原菌定殖和繁衍,在很大程度上影响病情发生发展[51],因此与室内苗期抗性鉴定结果相比,田间成株期发病程度普遍较轻。

2.3.3 苗期抗性评价成株期抗性的可行性与局限性分析

小麦茎基腐病苗期抗性与成株期抗性具有较高的相关性[13,38]。如Wildermuth等[37]和Mitter等[5]分别对28个和16个澳大利亚小麦品种进行苗期、成株期抗性鉴定,结果显示,苗期抗性与大田抗性鉴定结果呈高度正相关(r=0.78～0.98);冀春雨[39]对中国58个冬小麦品种进行鉴定,发现大田与温室的抗性结果基本一致。由于苗期室内鉴定条件易控制、发病一般较重,室内鉴定的部分抗病品种在大田中表现出良好抗性[15,36]。这些结果为利用苗期抗性评价成株期抗性奠定了基础,这可能也是目前茎基腐病抗性鉴定普遍采用苗期鉴定的主要原因。

也有不少研究结果表明,苗期抗性与成株期抗性相关性不高,一些苗期抗性良好的品种在成株期抗性较差[5],而一些苗期感病的种质在成株期表现为抗病[4],如苏麦3号在苗期对茎基腐病病原菌表现为高感,而在成株期表现为抗病[42]。另外,在不同的年份或不同试验方法鉴定中,同一品种对茎基腐病的抗性也会有明显差异[52-53]。Yang等[33]研究发现,源于Lang/CSCR6的RIL群体的苗期抗性与大田成株期抗性的相关性只有0.44,基于大田鉴定检测到2个QTL,只有4B染色体上效应小的QTL在苗期鉴定数据中能检测到,而3B染色体上效应大的QTL却没有检测到,这与Poole等[46]研究中“苗期与成株期的抗茎基腐病QTL不一致”的结论相符。可见,以苗期抗性鉴定结果预测成株期抗性有一定的局限性,这可能是苗期和成株期抗茎基腐病的遗传位点不完全相同[42]。作物对病害的苗期抗性和成株期抗性存在差异,这在小麦条锈病等病害中也有类似报道[54]。

可见,虽然苗期鉴定是当前茎基腐病抗性鉴定的主要方法,但是为了更客观评价小麦品种的茎基腐病抗性,经苗期抗性鉴定筛选出的抗病材料仍需要进一步进行多年多点的成株期抗性接种鉴定。

3 目前鉴定方法存在的主要问题

目前小麦茎基腐病抗性鉴定方法多样,但是操作简便、结果稳定、快速、高通量的方法缺乏,一定程度上制约了小麦抗茎基腐病育种的效率。

3.1 缺乏统一的标准

小麦茎基腐病抗性鉴定工作虽然一直在持续进行,但是国内外的研究大多不够深入,缺乏统一标准的鉴定方法[5],不同研究者采用不同的方法、对同一个种质的鉴定结果不一致。如陆宁海等[41]于2015年采用天然培养基(小麦)接种和病情指数法评价44个小麦品种的苗期抗性,发现百农207在苗期中抗茎基腐病;于2016年以同样的接种方法和病情指数法评价19个小麦品种的抗性,发现百农207在苗期中感茎基腐病[30]。而冀春雨[39]采用茎基部滴注法进行鉴定,发现百农207在苗期高感茎基腐病。因此,由于缺乏统一的鉴定方法和评价标准,导致不同学者的抗病鉴定结果不同,给小麦茎基腐病研究及育种工作者带来一定的困难。

3.2 不利于高通量检测

多数现有的小麦茎基腐病抗性鉴定方法由于缺乏重复性和不适合高通量筛选,而不能有效评估育种中大量新品系的抗性[37,45,48]。如Mitter等[5]提出的茎基部滴注法,需要在相同的位置接种每株幼苗,接种后还要留出足够的空间容纳植株;小烧杯法、套菌碟法有利于快速发病[29,41],但是由于每株幼苗都要套菌碟或插入培养基中、操作起来比较麻烦、耗时长,主要用于致病菌毒性测定;天然培养基接种法应用居多,但是需要土培盆栽,占用较大的空间且鉴定所用的时间较长,不同研究者所用土壤介质也较难统一,导致试验结果会存在一定的误差[4,44,48]。

4 关于小麦茎基腐抗性鉴定的建议

针对目前茎基腐病抗性鉴定方法多样、不同学者鉴定结果无法相互比较、同一种质因鉴定方法不同而结果不一致的现象,提出2点建议,以期为准确鉴定小麦茎腐病抗性提供有用信息。

4.1 加强苗期抗性鉴定的标准化

苗期鉴定快速高效、重复性强,又能在一定程度上反映成株期抗性,可以从接种方式、植株培养条件、记载评价等方面建立国际认可的标准鉴定方法,从而使不同的鉴定结果能够相互比较。

接种方法:现有的苗期接种鉴定方法一般都可以区分抗、感品系,从高通量的角度考虑,孢子液浸泡法和天然培养基接种法比较可行。鉴定过程中,幼苗何时处理、孢子液浓度、使用前是否添加吐温(Tween)[36]或甲基纤维素(Methyl cellulose)[44]等辅助剂以及浸泡时间等关键环节要有明确的标准。经过不少学者的努力,已初步建立了孢子液浸泡的接种程序:催芽2～3 d的萌发种子,在浓度为1×105～5×106个·mL-1的孢子液中(加吐温20,0.1% v/v)浸泡1～2 min,然后移栽,黑暗保湿24或48 h[33-34,50],如果是大田播种,则在播种前 2 d用吐温20浸泡处理,晾干后播种[46]。天然培养基接种法的培养基以病小米粒[4,32]或小麦粒[41-42]较多,病谷粒于播种时放在种子上方[4,37,46]或一叶一心至三叶期时放在苗基部[41-42]进行接种,这些研究为建立标准的接种方法奠定了良好基础。

植株培养条件:植物培养条件是影响病害发展的重要因素。培养温度、湿度以及光照时间等因素都需要标准化。国内外学者对此也进行了不少研究。如研究发现,最适培养温度为24～27 ℃时[24,27],适度的缺水会加剧植物茎基腐病的发生,增加植株死亡率[54]。一般在接种前期保持湿润、而后期出现萎蔫现象时才浇水,可促进茎基腐病的发展[34,36]。Mitter等[5]优化了接种后适宜茎基腐病发展的培养条件,即白天(光照)12 h,25 ℃,相对湿度60%;晚上(黑暗)12 h,15 ℃,相对湿度80%。多名学者均采用了这一培养程序[23,31,44,46]。

评价标准:目前,叶鞘发病级别[5,31,37,45]、病蘖率[4,29,37,48]、白穗率[4,7,30,42]、产量损失率[7,48]等都可以作为评价茎基腐病抗性的依据,尚无统一标准。因为苗期接种后症状主要表现在第1～3叶鞘,不同叶鞘发病程度也有差异[5,31,39,45],所以,苗期抗性主要依据叶鞘发病等级计算的病情指数进行评价。叶鞘发病级别的三种记载方法(茎基腐症状分级、严重度指数、叶鞘症状得分和)都能显著的区分抗、感品种(P值在0.000 3～0.026 5之间),且鉴定结果高度相关(相关系数在0.86～ 0.92之间)[43,46],其中,以茎基腐症状分级的记录方法最节约时间,其所用时间是严重度指数的50%,叶鞘症状得分和的70%[46]。苗期鉴定标准方法的建立要充分考虑接种均匀性、培养条件、记载时间与标准的一致性,以增强鉴定结果的稳定性与可靠性。

4.2 加强成株期抗性鉴定的研究

受气象因素等诸多因素的限制,小麦茎基腐病成株期抗性鉴定方法的研究很少,急需建立标准的鉴定方法。

在茎基腐病发生严重的地块,进行自然病圃鉴定[43]是可行的办法,但由于茎基腐病受气象因子的影响较大,导致鉴定结果在年度间存在较大差异。另外,由于致病菌分布不均匀或不充分,导致发病率低或者部分植株“避病”,这对检测纯系品种抗性时所受影响较小,然而在育种或基因定位中往往需要对分离群体进行鉴定、尤其是F2群体抗性鉴定时,每个单株的鉴定结果可能不一样,而“避病”现象对鉴定结果的影响很大[48]。所以,应对接种时期、接种方式及保湿方法等重要因素进行探究,建立标准鉴定方法。

接种时期:Moyano等[55]研究认为,小麦最易感茎基腐病的时期是抽穗期和扬花后期,提前接种会导致灌浆和扬花期延长,使病害加重。Dodman等[48]对出苗期、拔节期、抽穗期、乳熟期接种的结果也表明,接种时间越早、病情越严重。目前采用病谷粒法接种的大田抗病性鉴定一般在播种时将病谷粒洒在种子上方或与土混匀后播种[4,45-46],但播种时接种会导致严重的幼苗枯死现象[6,48],因此应开展不同生育期进行接种鉴定的研究,以明确接种的关键期。

接种方法:Dodman等[48]认为播种时将病谷粒施入土壤中是一种合适的方法,可以提高病害水平,这也是目前常用的大田鉴定接种方法[4,45-46]。基于此,Dodman等[48]建立了大田接种鉴定的标准方法,即种植时将病谷粒粉(病大麦与小麦粒晾干磨碎过筛后1∶1混合)施入土壤中中,1行1 m的施用量为3.0 g)。

记录方法及评价标准:成株期的评价指标较多,主要有病蘖率、茎秆症状严重程度、白穗率、产量损失率[4,30,37,48]等。白穗率是评价茎基腐病抗性的快速方法,然而,白穗发育也受环境因素影响,多种病害如根腐病、赤霉病、纹枯病都能引起白穗,故不适宜作为常规指标用于茎基腐病的抗性鉴定[48]。产量是小麦生产者最感兴趣的部分,茎基腐病对产量有显著影响[6],然而产量的影响因素很多,也不适宜作为茎基腐病成株期抗性的唯一指标。有研究者发现,产量损失与病蘖率之间存在显著的相关性[48],因此,病蘖率可以作为评价茎基腐病抗性的可靠指标。从目前的研究结果看,病蘖率结合茎秆症状严重程度可以作为成株期抗性评价的指标,如果想了解品种对茎基腐病的耐受性,则要结合产量、白穗率等进行综合判定。

总之,对于大量材料,可以先进行苗期鉴定、然后对初筛过的材料再进行大田成株期抗性鉴定,以减少工作量。另外,小麦茎基腐病和赤霉病都是由镰刀菌属真菌引起的病害,抗赤霉病有抗侵入(Type I)、抗扩展(Type II)、抗毒素积累(Type III)、低病粒率(Type IV)、寄主耐病性(Type V)等五种抗病类型[56],茎基腐病抗性可能也有不同类型,如在Dodman等[48]将孢子液接种在茎表面时,抗病品种(Gala)的症状显著低于感病品种(Gamut)(抗侵入);但是当将孢子液注射进茎中时,抗感品种间差异不显著(抗扩展)。不同抗性鉴定方法各具特色,天然培养基接种法比较适合大量育种材料或遗传群体的鉴定[32,39];茎基部滴注法有助于研究茎组织上病害的生物学和发展过程[46];小烧杯法、套菌碟法和棉球接种法则适用于病原菌的致病力检测[3,24,35]。根据不同的研究目的,建立快速、高效、简便、重复性高的标准鉴定方法,是进行小麦茎基腐病抗性鉴定、抗性位点检测及抗病机制研究的基础。