石新烨 孙经武 刘振 刘婧玚 董文敬 张翠

细胞死亡在机体发育、内环境稳态和疾病的发生发展过程中起关键作用，人们对细胞死亡的认识经历了漫长的过程。目前认为细胞死亡形式主要分为两大类：非程序性细胞死亡，即坏死（Necrosis）；程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）。PCD 可以分为裂解性细胞死亡和非裂解性细胞死亡[1]，前者包括坏死性凋亡（Necroptosis）和细胞焦亡（Pyroptosis），这两种死亡使得细胞内含物外漏，引起炎症反应，因此称为炎症性死亡。后者最典型的是细胞凋亡（Apoptosis）。细胞焦亡与多种疾病的发生有关，如：动脉粥样硬化、心力衰竭、心血管疾病、糖尿病及其并发症、痛风及肿瘤等。近年来发现细胞焦亡及其相关蛋白广泛存在于心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）过程中，参与MIRI 的发生发展。在临床治疗上既要尽早恢复缺血组织的血流，又要减轻或防止再灌注对器官造成的二次损伤。现探讨细胞焦亡的研究进展及其对MIRI 的作用机制及相关通路研究，进一步分析各种药物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 细胞焦亡的形态学和分子特征

1.1 细胞焦亡的形态学特征细胞焦亡是PCD 的一种新形式，在形态学上[2]兼具细胞坏死（质膜完整性丧失）和凋亡（DNA 片段化和核固缩），其中凋亡是由基因调控自主有序的生理性死亡，DNA 片段有序细胞核碎片状，而焦亡是在病理状态下诱发产生，DNA 片段随机且细胞核完整。坏死和焦亡均存在质膜破裂，与坏死爆炸样破裂不同的是焦亡导致细胞变扁，焦亡会发生膜泡变形成囊泡状结构（称为焦亡小体）。当发生焦亡时，细胞膜上会形成直径为1.1～2.4nm 的微小孔隙，发生渗透性溶解活性物质释放至胞外，最终导致细胞破裂死亡，同时激发免疫反应扩大炎症反应。

1.2 细胞焦亡的分子特征

1.2.1 炎症小体 炎症小体的基本结构：位于细胞质内的感受器模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRRs）；效应器Caspase-1 前体（Pro-caspase-1）；连接受体蛋白和效应蛋白起桥梁作用的凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis associated speck-like protein containing，ASC）。PRRs 的成员：核苷酸结合寡聚结构域（NOD），富含亮氨酸重复序列（LRR）的蛋白质（NLR）家族成员，黑色素瘤缺乏因子2 样受体（AIM2），以及含有TRIM 家族成员蛋白Pyrin。其 中NLRP1、NLRP3 和NLRC4 和小鼠Nlrp1a 和Nlrp1b 已明确可以形成炎症小体。也有研究[3]发现，HIV 病毒蛋白酶可激活由CARD8 炎症小体介导的细胞焦亡，使患者CD4+T 细胞中潜伏的HIV 被清除，因此CARD8 为HIV 的炎症小体传感器。

NLRP3 是目前研究最明确的炎症小体，是由氨基末端热蛋白结构域（PYD）、NOD、c 端富含LRR结构域和CARD 结构域构成。炎症小体激活存在双信号模型：信号一由微生物成分或内源性细胞激酶发挥启动信号，导致转录因子NF-κB 激活，使信号分子MyD88 和TRIF 均可调控toll 样受体（TLRs）配体，从而上调NLRP3 和pro-IL-1β[4]。DDX3X在甲型流感病毒（IAV）感染期间先天抗病毒免疫反应至关重要，研究表明[5]其可激活NLRP3 炎症小体介导细胞焦亡、组装应激颗粒及I 型干扰素（IFN）宿主反应进行防御。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶NEK-1 通过与NLRP3 的LRR 结构域相互作用，形成NEK7-NLRP3 复合物，促进NLRP3 炎症小体的激活[6]。信号二由离子通量（K+外排、Ca2+动员、Cl-外排和Na+内流）、线粒体功能障碍和活性氧（ROS）的产生以及溶酶体损伤广泛的刺激并激活NLRP3。

1.2.2 Caspase 家族 半胱天冬酶是一种保守的半胱氨酸蛋白酶家族，由氨基末端半胱天冬酶募集结构域（CARD）、中央大催化结构域和羧基末端小催化亚基结构域组成，共同参与酶活性中心的形成。Caspases 分类包括：与炎症相关的Caspase-1，4，5，11，12，其激活可介导焦亡；与凋亡相关的Caspase-2，8，9，10（凋亡起始）和Caspase-3，6，7（凋亡执行）。研究发现除了Caspase-1 活性位点与GSDMD N 和C 端结构域连接器的接合外，L2和L2’环上的反平行β 片在其N-端结构域远端与GSDMD C-端结构域内结合了一个疏水口袋，揭示了Caspase-1 通过两个不同的界面介导对GSDMD 特异性剪切[7]。在焦亡介导底物GSDMD缺失的情况下，Caspase-1 激活Caspase-3，7 并诱导细胞凋亡，间接说明Caspase-1 诱导焦亡可能只有唯一的底物，即GSDMD。同时在细胞凋亡过程中，Caspase-3，7 在Asp87 位点切割GSDMD，可导致GSDMD 的焦亡活性失活，此实验表明焦亡与凋亡存在双向干扰[8]。同样Caspase-8 在细胞焦亡和细胞凋亡中均可发挥作用，它可以激活NLRP3 对GSDMD 进行切割。

1.2.3 Gasdermin 蛋白家族 Gasdermins 是功能多样的蛋白质家族，主要在皮肤、胃肠道和免疫细胞中表达，其在粘膜屏障系统中发挥作用。现发现的GSDMs 主要有6 种：GSDMA～E 和DFNB59。除了DFNB59，其余GSDMs 均含有高度保守的N-末端和C-末端，其中C 端结构域作为抑制结构域而限制N 端功能。GSDMD 蛋白是细胞焦亡Caspase的共同底物效应执行蛋白，在两条焦亡通路中均扮演着关键角色，NF-κB/GSDMD 轴作为桥梁影响NLRP3 凋亡小体介导的焦亡。此外，大量研究证实SADMA、GSDMB、GSDMC、GSDME 在某种情况下均可诱导焦亡的发生。

2 细胞焦亡通路

2.1 经典细胞焦亡途径由炎症小体组装介导并伴 有GSDMD 裂解和IL-1β 和IL-18 释放。炎症小体的组装起始于PRRs 通过识别病原相关分子（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）和非病原相关宿主来源的危险信号分子（Danger associated molecular patterns，DAMPs）危险信号分子的刺激，NLRP3 通过每个蛋白中的PYD 相互作用，招募ASC 从而为ASC 丝状形成提供成核平台，丝状ASC“斑点”通过CARD-CARD 相互作用促进Caspase-1 的招募和激活。Caspase-1 被ASC 招募激活后一方面剪切Pro-IL-1β 和Pro-IL-18，促进IL-1β 和IL-18 的成熟与释放，招募更多的炎症细胞聚集，扩大炎症反应，提高机体先天性免疫防御能力，达到保护宿主细胞的目的。另一方面激活的Caspase 特异性剪切 GSDMD，将N-末端从具有自我抑制作用的C-末端释放出，GSDMD-N 与脂质结合形成非选择性孔隙，不依赖于增加渗透压来破坏细胞，最终细胞膜破裂并伴随大量炎性因子释放，触发细胞焦亡[9]。

2.2 非经典细胞焦亡途径研究发现革兰氏阴性细菌的胞质识别依赖于Caspase-4，5，11 的存在以触发NLRP3 炎症激活，证明Caspase-11 激活独立于NLRP3 炎症小体激活焦亡发生，为了与已知的依赖于Caspase-1 的炎症小体途径区别开来，这种新的炎症小体参与途径被称为非经典细胞焦亡途径。Caspase-4，5，11 激活后直接裂解GSDMD 成GSDMD-N 并寡聚转移到细胞膜，最终形成质膜孔并触发焦亡。有研究发现激活的Caspase-11 可特异性剪切和修饰通道蛋白Pannexin-1，引起细胞ATP 的释放致离子通道P2X7 开放，使钾钠钙离子外流，细胞发生渗透性肿胀进而发生膜破裂[10]。但此途径激活的Caspase-11 不能剪切IL-1β 和IL-18，使IL‐1β 和IL‐18 成熟并释放。

2.3 其他途径Deng 等[11]发现A 组链球菌（GAS）的SpeB 毒力因子通过Gln246 裂解GSDMA，释放一个激活的N 端片段来触发角化细胞焦亡，而GSDMA 基因缺陷减弱了小鼠对GAS 的免疫反应，导致不受控制的细菌传播和死亡。细胞毒性淋巴细胞中的颗粒酶A（Granzyme A，GzmA）通过穿孔素进入靶细胞，在Lys229/Lys244 位点水解GSDMB 诱导焦亡，将GzmA 引入小鼠癌细胞，可促进小鼠肿瘤清除[12]，为治疗肿瘤提供新靶点，同时GSDMB 作为一种抗菌细胞溶酶，在炎症性肠病患者的GSDMB 增多过程中可促进上皮细胞的恢复和修复，但不依赖于焦亡[13]。Hou 等[14]发现巨噬细胞来源的TNF-α 激活的Caspase-8 可在ASP365位点将GSDMC 裂解为N-GSDMC，阻止Caspase-8招募Caspase-3 参与凋亡过程。Zhang 等[15]发现颗粒酶B 可诱导成熟的Caspase-3 裂解GSDME，并在Asp270 处直接切割GSDME，同时诱导独立于Caspase 的焦亡，使表达GSDME 的细胞将非炎性凋亡转化为焦亡，从而发挥抑制肿瘤的作用。以上研究说明GSDMA、GSDMB、Caspase-8/GSDMD、Caspase-3/GSDME 均为细胞焦亡相关通路。

3 细胞焦亡参与心肌缺血再灌注损伤的机制

3.1 氧化应激缺血再灌注产生的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）通过对复合物Ⅰ/Ⅲ的氧化损伤使线粒体ROS 的产生和氧化还原功能发生障碍，强烈增强蛋白质半胱氨酸磺化和损害血红素完整性致心肌细胞损害[16]。在创伤性脑损伤模型中，NADPH 氧化酶可使脂肪酸氧化增加，激活NLRP3 炎症小体，进一步给予NLRP3 炎症小体的抑制剂INF4E 可以改善线粒体功能，发挥保护MIRI 和改善心肌功能损伤作用[17]。以上均表明线粒体功能障碍和线粒体ROS 的产生在NLRP3 炎症小体激活中是不可缺少的。

3.2 钙离子超载心肌缺血后调节相关交换体的活性及肌浆网Ca2+-ATP 酶功能障碍使细胞内钙离子超载，其可激活蛋白酶与钙依赖性磷脂酶活性，致生物膜完整性破坏、肌原纤维收缩、线粒体破坏、ATP 耗竭及心肌顿抑等不良后果。因此钙通路调控因子在MI/R 损伤中发挥重要作用。Chen 等[18]研究证明，Ugonin U 通过Ca2+动员和线粒体ROS的产生激活NLPR3 炎症小体。其激活机制可能是：Ca2+的增加促进NLRP3 和ASC 之间的相互作用；Ca2+的增加诱导线粒体功能障碍进而导致NLRP3炎症小体激活。也有研究[19]表明，在无Ca2+培养的巨噬细胞诱导K+外排也可触发NLRP3 炎症小体激活。综上，钙离子超载可以激活NLRP3 炎症小体但不是必需条件。

3.3 内皮细胞功能损伤内皮细胞受ROS 的攻击使缩血管活性物质增多，同时表达炎性因子及大量NO 导致ROS、蛋白酶等毒性因子介导的细胞毒性增强，均加重心肌细胞受损。Sun 等[20]在建立心脏微血管内皮细胞和MIRI 动物模型中观察到NLRP3炎症小体的激活和焦亡，并且通过天麻素的干预可阻断焦亡发生，改善MIRI。在小鼠MIRI 模型中BECN1 基因可以调节Caspase-4 介导心肌微血管内皮细胞焦亡[21]。综上，细胞焦亡在内皮细胞功能损伤致MIRI 中发挥作用。

3.4 自噬缺血时自噬激活可减弱心肌缺血再灌注损伤[22]，而再灌注时自噬过度激活可加重心肌缺血再灌注损伤。自噬可直接清除炎症小体，也可消除炎症刺激：如ROS、线粒体脱氧核糖核酸或受损的细胞器）来减轻炎症，维持体内稳态。有研究发现高糖抑制了H9C2 心肌细胞的自噬，激活了NLRP3炎症小体，加重了心肌缺血再灌注损伤，使用雷帕霉素激活自噬可抑制NLRP3 炎症小体，最终缓解心肌缺血再灌注损伤[23]。以上表明适度自噬可以通过抑制细胞焦亡发挥改善MIRI 作用。

4 通过细胞焦亡通路对心肌缺血再灌注损伤进行保护的药物

4.1 抑制细胞焦亡相关通路对MIRI 发挥保护作用研究发现[24]，牛舌草总黄酮（TF）在小鼠MIRI 模型中可以通过ROS/TXNIP/NLRP3 通路发挥抗MIRI作用。Geniposide 促进AMPK 磷酸化激活后降低炎症小体及IL-1β、IL-18 的基因和蛋白表达水平，进而改善能量代谢，从而抑制NLRP3，降低ROS 水平的表达[25]。七氟醚通过抑制P2X7-NLRP3 信号通路抑制IL-1β、IL-18 和GSDMD 的表达，从而调节炎症反应和焦亡保护心功能[26]。曲美他嗪（TMZ）及大黄素可以降低TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 炎症小体通路蛋白水平，缓解心肌缺血再灌注损伤[27]。心肌成纤维细胞分泌外泌体将miR-133a 传递到心肌细胞，抑制心肌细胞焦亡保护心肌[28]。综上，通过抑制炎症小体的激活及下游蛋白的表达可发挥保护心肌的作用。

4.2 临床药物的研究

4.2.1 研究发现糖尿病以AMPK 依赖的方式产生氧化应激反应介导细胞焦亡，加重大鼠MIRI 程度。大量研究发现多种降糖药可通过抑制细胞焦亡减轻MIRI。胰岛素通过丙酮酸脱氢酶e1α 亚基（PDHA1）的去磷酸化可以减少因NLRP3 激活焦亡诱导的炎症，显著降低心肌梗死面积，改善心脏血流动力学、病理改变及能量代谢[29]。二甲双胍可减少促炎细胞因子并减少NLRP3 炎症小体的激活，增加细胞活力，降低LDH 的释放以及缩小心肌梗死面积、抑制心肌纤维化，达到减轻MIRI 和细胞焦亡的作用[30]。在巨噬细胞中用NLRP3 刺激处理后给予格列本脲，发现该药物以剂量依赖的方式抑制NLRP3 炎症小体的激活和IL-1b 的释放[31]。小分子16673-34-0 是格列本脲合成的中间底物，可抑制心肌细胞NLRP3 炎症小体的形成，限制小鼠心肌缺血再灌注损伤后的梗死面积，而不影响葡萄糖代谢[32]。

4.2.2 褪黑素能降低小鼠主动脉内皮组织中与焦亡相关基因的表达，包括NLRP3/ASC/Caspase-1、NFκB/GSDMD、IL-1β 和IL-18，通过序列互补抑制miR-223 的功能，可以阻断褪黑素以上作用并增加NLRP3 的表达，表明褪黑素通过MEG3/miR223/NLRP3 轴防止内皮细胞焦亡[33]。抑制TLR4-NLRP3介导的焦亡对大鼠缺血再灌注损伤有保护作用，表明褪黑素通过TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 炎症小体通路对肝脏缺血/再灌注损伤的发病起重要作用。

4.2.3 秋水仙碱 接受经皮冠状动脉介入治疗的ST段抬高型心肌梗死患者服用0.5mg 的秋水仙碱可减少心肌梗死面积和心肌炎症反应，显著降低缺血性心血管事件的风险[34]。在AMI 小鼠模型中[35]，短期使用秋水仙碱治疗可显著降低NLRP3 炎症小体的激活和NLRP3 下游焦亡相关蛋白的表达，改善心功能、心力衰竭和心肌梗死后的生存质量。表明秋水仙碱通过抑制NLRP3 介导的心肌细胞焦亡而抑制AMI 后的炎症反应和心室重构。

缺血的心肌组织恢复血供后可造成进一步损害并影响心肌纤维结构、电生理功能、心肌代谢功能及心脏泵功能，从而削弱冠状动脉血运重建治疗的疗效，因而寻找减轻再灌注损伤药物对心肌缺血疾病至关重要。大量研究表明细胞焦亡与心肌缺血再灌注损伤有关，本研究探讨了细胞焦亡与MIRI之间的联系，发现缺血再灌注从多方面均可诱导细胞焦亡进而损伤心肌细胞，为后续药物抑制细胞焦亡减少心肌损伤提供依据。也有研究提出相反意见，表示目前的文献主要关注其在急性心肌缺血再灌注损伤中的有害影响，但不能忽略的是在一定条件下还可能参与心脏保护信号传导。在猪MI 模型中，我们在其体内未观察到NLRP3 炎症小体抑制后炎症反应的减弱[36]。炎症是一把双刃剑，在过度活跃时有害，但在活性较低时有益，其活性严重程度依赖于再灌注时间和细胞位置，继续深入研究细胞焦亡参与MIRI 的发生机制有望为其提供有效靶点，与此同时在开始使用细胞焦亡抑制剂进行临床试验之前，需充分了解NLRP3 炎症小体在心肌缺血再灌注损伤中的作用。