王海滨,李 平,张志刚,周万淼

张家口市第二医院骨科,河北张家口 075000

膝骨关节炎是膝关节处发生的一种慢性退行性疾病,其典型特征为关节软骨降解、肌肉萎缩、关节局部炎症、骨赘形成等,会引发患者关节僵硬疼痛、变形失用等关节功能障碍,严重降低了其生活质量,是造成残疾的主要原因之一[1-2]。膝骨关节炎发病机制复杂,其中促炎细胞因子引发的炎症级联反应及软骨机制降解退化被认为是其主要病理机制,减轻炎症与软骨损伤可明显延缓膝骨关节炎进展[3-4]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)作为是重要的炎症相关通路可激活下游核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体信号,诱发炎症反应,抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信号激活可减轻镉诱导的肾脏炎症损伤[5],研究显示,下调MAPK/NF-κB通路可通过抑制破骨细胞激活延缓软骨下骨重塑[6],还可阻止NLRP3炎症体激活,通过抗炎和抗氧化作用显著减轻软骨侵蚀、细胞外基质降解,进而缓解骨关节炎进展[7],因而MAPK/NF-κB/NLRP3可作为防治膝骨关节炎的重要靶点。连翘苷是传统中药连翘的果实提取物,现代研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎的生理作用,可降低p38 MAPK磷酸化,抑制牙周炎症及破骨细胞活化,减轻牙周炎大鼠牙周组织损伤[8],还可抑制NF-κB信号活化,减轻骨关节炎大鼠软组织损伤和基质降解[9],但连翘苷是否可通过抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信号激活而减轻膝骨关节炎大鼠软骨损伤,目前还尚未有明确阐释,本文以连翘苷处理膝骨关节炎大鼠模型,对此课题进行研究,现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠,体重200～230 g,雄性,SPF级,购于云南生物谷药业股份有限公司,生产许可证号:SYXK(滇)K2018-0009。于维持屏障环境的动物中心饲养房中喂养,饲养房内温度维持22～25 ℃,湿度维持55%～65%,照明维持明暗各12 h交替。

1.2仪器与试剂 C16-PAF(MAPK激活剂,纯度:99.48%,货号HY-108635)购自美国MCE公司;碘乙酸钠(MIA,纯度:98%,货号4386-10G)购自美国Sigma公司;连翘苷(纯度:HPLC≥98%,货号IP0700)购自北京索莱宝科技有限公司;兔源抗大鼠Anti-Bax一抗(货号PA5-11378)购自美国Cell Singaling Technology公司;TUNEL检测试剂盒(货号ab206386)、大鼠白细胞介素(IL)-18酶联免疫吸附试验(ELISA,货号ab213909)、RIPA裂解液(货号ab288006)、大鼠IL-1β ELISA试剂盒(货号ab255730)、HRP偶联山羊抗兔二抗(货号ab97051)、大鼠前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒(货号ab287802)、兔源抗大鼠Anti-基质金属蛋白酶(MMP)3一抗(货号ab52915)、兔源抗大鼠Anti-NLRP3一抗(ab232401)、兔源抗大鼠Anti-β-actin一抗(货号ab8227)、兔源抗大鼠Anti-MMP9一抗(货号ab228402)、兔源抗大鼠Anti-caspase-3一抗(货号ab184787)、兔源抗大鼠Anti-p-NF-κB p65一抗(ab239882)、兔源抗大鼠Anti-NF-κB p65一抗(货号ab16502)、兔源抗大鼠抗大鼠Anti-p-p38 MAPK一抗(货号ab17942)、兔源抗大鼠Anti-p38 MAPK一抗(货号ab181602)购自美国Abcam公司。透射电镜(型号LVEM25)购自美国Delong Instrument公司;轮转式石蜡切片机(型号KD202C)购自上海特惠仪器设备有限公司;生物显微镜(型号LW200ET-A)购自上海尖端光电科技有限公司;全波长多功能酶标仪(型号CLARIOstar Plus)购自德国BMG Labtech公司;转移电泳槽(型号KEEBIO-VE186)、电泳仪(型号Keebio-miniES)、电泳仪电源(型号KEEBIO-600N)购自上海金鹏分析仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1制备膝骨关节炎大鼠模型及分组处理 采用经典MIA法制备膝骨关节炎大鼠模型,具体方法参照文献[10]:将MIA溶解到生理盐水中制备为20 mg/mL的溶液,取SD大鼠以6 mL/kg的剂量腹腔注射质量分数为1%的戊巴比妥钠麻醉,将后部右侧膝关节附近剔除鼠毛后消毒,于其关节腔内各注射MIA溶液5 0 μL,5 d后观察到大鼠双侧关节红肿,发生明显炎症,提示造模成功,随机分为模型组、连翘苷组、C16-PAF组、连翘苷+C16-PAF组,每组10只,另选10只大鼠于其双侧关节腔内各注射生理盐水50 μL,作为对照组。

将连翘苷和C16-PAF溶于生理盐水制为5 mg/mL的连翘苷药液和4 μmol/L的C16-PAF药液,连翘苷组大鼠腹腔注射10 mL/kg的连翘苷药液(剂量达到50 mg/kg)[11],同时于其后部右侧关节腔内各注射生理盐水50 μL;C16-PAF组大鼠于其后部右侧关节腔内各注射4 μmol/L的C16-PAF药液50 μL[12],同时腹腔注射10 mL/kg的生理盐水;连翘苷+C16-PAF组大鼠腹腔注射10 mL/kg的连翘苷药液(剂量达到50 mg/kg),同时于其后部右侧关节腔内各注射4 μmol/L的C16-PAF药液50 μL;模型组、对照组大鼠腹腔注射10 mL/kg的生理盐水,同时于其后部右侧关节腔内各注射生理盐水50 μL,各组大鼠均每天给药处理1次,处理21 d完成给药。

1.3.2测量各组大鼠关节肿胀度及关节功能 各组大鼠于建模前使用软尺测量大鼠后部同侧膝关节周径(记为r1),21 d给药完成后24 h,再次测量其后部同侧膝关节周径(记为r2),关节肿胀度计算公式:关节肿胀度=(r2-r1)/r1×100%。采用步态评分和爪压评分评测大鼠关节功能[10],观察大鼠自由活动时步态并进行评分:步态正常且双足均匀着地,评0分;轻度跛行且患侧下肢略弯曲,评1分;中度跛行且患侧下肢刚触及地面,评2分;重度跛行且患侧下肢离开地面,评3分;大鼠放入透明玻璃室(20 cm×25 cm×25 cm)内,于其下面斜放成45°角的镜子来清晰观察大鼠自由活动时后爪下压情况并进行评分:两后爪下压情况正常,评0分;患侧后爪下压轻微减轻,即爪子完全在地板上但脚趾不完全张开,评1分;患侧后爪下压情况适度减轻,即部分爪子轻触地面且爪子弯曲,评2分;患侧后爪下压情况严重降低减轻,即爪子完全抬高,评3分。

1.3.3透射电镜检测各组大鼠关节软骨形态及采集标本 关节功能评测结束后,麻醉大鼠(方法见1.3.1),采集其腹动脉血离心得到血清,保存在-80 ℃备用;解剖剥出各组大鼠患侧关节软骨,取下大约1/3的组织块,生理盐水冲洗后,2%的戊二醛固定24 h后漂洗、1%的四氧化锇固定2 h后漂洗、(60%、70%、80%、95%、100%)乙醇逐级脱水、醋酸异戊酯浸泡过夜、树脂包埋、固定于超薄切片机上切片,得到厚约80 nm的切片,放置在载物台上,经真空喷金后采用扫描电镜观察软骨形态并摄片;剩余关节软骨组织剪下约0.4 g存在液氮中备用,剩余的组织生理盐水冲洗、4%的多聚甲醛固定24 h、生理盐水漂洗、(60%、70%、80%、95%、100%)乙醇逐级脱水、二甲苯透明、热石蜡包埋、固定于轮转式石蜡切片机上切片,得到厚约4 μm的切片备用。

1.3.4TUNEL染色检测各组大鼠关节软骨细胞凋亡 取出1.3.3中厚约4 μm的关节软骨组织切片,二甲苯脱蜡、(100%、95%、80%、70%、60%)乙醇逐级水化、蒸馏水洗涤后采用TUNEL检测试剂盒进行染色,蒸馏水洗涤后采用生物显微镜观察软骨凋亡情况并摄片,以Image J软件定量图片中软骨凋亡细胞数及总细胞数算出软骨细胞凋亡率,计算公式:软骨细胞凋亡率=软骨凋亡细胞数/软骨总细胞数×100%。

1.3.5ELISA检测各组大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平 取出1.3.3中存于-80 ℃的各组大鼠血清,冰水浴中解冻后采用ELISA试剂盒测定其中IL-18、IL-1β、PGE2水平,具体操作参照各自说明书指导进行。

1.3.6检测各组大鼠膝关节软骨组织SIRT1/HMGB1信号通路相关蛋白表达 取出1.3.3中存于液氮的各组大鼠关节软骨组织,加入RIPA裂解液匀浆提取出其中总蛋白,测量浓度后每组取15 μg总蛋白煮沸变性,依次进行电泳、湿转将其分离后转膜,封闭后剪下NLRP3、β-actin、caspase-3、Bax、MMP3、MMP9、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白,以相应的兔源一抗和HRP偶联山羊抗兔二抗依次孵育、洗涤,显色后摄片,采用Image-J分析定量各蛋白相对表达。

2 结 果

2.1连翘苷对大鼠关节肿胀度和关节功能的影响 与模型组比较,连翘苷组大鼠关节肿胀度、步态评分和爪压评分降低(P<0.05),C16-PAF组大鼠关节肿胀度、步态评分和爪压评分升高(P<0.05);与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠关节肿胀度、步态评分和爪压评分降低(P<0.05)。对照组无关节肿胀,步态评分和爪压评分均为0分。见表1。

表1 各组大鼠关节肿胀度、步态评分和爪压评分

2.2连翘苷对大鼠关节软骨超微结构形态的影响 对照组大鼠关节软骨软骨细胞形态完好,胞质内含有大量线粒体,粗面内质网丰富且排列整齐。模型组大鼠关节软骨超微结构受损:软骨细胞线粒体肿胀出现空泡,胞质内粗面内质网扩张甚至断裂溶解、排列杂乱、数量减少。与模型组相比,连翘苷组大鼠关节软骨超微结构形态有所恢复,受损减轻;C16-PAF组大鼠关节软骨超微结构形态受损症状加重。与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠关节软骨超微结构形态受损症状减轻。见图1。

注:A为对照组,B为模型组,C为连翘苷组,D为C16-PAF组,E为连翘苷+C16-PAF组。

2.3连翘苷对大鼠关节软骨细胞凋亡的影响 与对照组[(3.02±0.85)%]相比,模型组大鼠关节软骨细胞凋亡率[(34.41±7.73)%]升高(P<0.05);与模型组相比,连翘苷组大鼠关节软骨细胞凋亡率[(6.07±2.02)%]降低(P<0.05),C16-PAF组大鼠关节软骨细胞凋亡率[(61.58±13.41)%]升高(P<0.05);与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠关节软骨细胞凋亡率[(30.13±6.79)%]降低(P<0.05)。见图2。

注:A为对照组,B为模型组,C为连翘苷组,D为C16-PAF组,E为连翘苷+C16-PAF组。

2.4连翘苷对大鼠血清促炎因子IL-18、IL-1β、PGE2水平的影响 与对照组相比,模型组大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平升高(P<0.05);与模型组相比,连翘苷组大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平降低(P<0.05),C16-PAF组大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平升高(P<0.05);与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平

2.5连翘苷对大鼠软骨组织基质降解相关蛋白和凋亡蛋白表达的影响 与对照组相比,模型组大鼠软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,连翘苷组大鼠软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表达降低(P<0.05),C16-PAF组大鼠软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表达升高(P<0.05);与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表达降低(P<0.05)。见图3、表3。

注:A为对照组,B为模型组,C为连翘苷组,D为C16-PAF组,E为连翘苷+C16-PAF组。

表3 各组大鼠软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白相对表达

2.6连翘苷对大鼠软骨组织MAPK/NF-κB/NLRP3相关蛋白表达的影响 与对照组相比,模型组大鼠软骨组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,连翘苷组大鼠软骨组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表达降低(P<0.05),C16-PAF组大鼠软骨组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表达升高(P<0.05);与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠软骨组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表达降低(P<0.05)。见图4、表4。

注:A为对照组,B为模型组,C为连翘苷组,D为C16-PAF组,E为连翘苷+C16-PAF组。

表4 各组大鼠软骨组MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白相对表达

3 讨 论

膝骨关节炎作为一种中老年人群高发疾病,随着我国老龄化进程的加深,膝骨关节炎已逐渐成为一个棘手的医疗问题,目前膝骨关节炎的临床治疗选择有限,主要是一些甾体类抗炎药、阿片类镇痛药等,疗效受限或不良反应大是普遍存在的问题,因此寻找开发新型治疗药物是膝骨关节炎临床研究的重要目标[13-14]。本研究采用经典MIA法制备膝骨关节炎大鼠模型,结果显示,造模大鼠血清促炎因子IL-18、IL-1β及PGE2水平明显升高,触发强烈炎症反应,引发大鼠关节软骨超微结构受损及软骨细胞凋亡,使大鼠关节肿胀度、步态评分和爪压评分明显升高,表明大鼠于关节腔内注射MIA后,关节肿胀且功能受损,提示膝骨关节炎模型构建成功。

膝骨关节炎的发生发展与促炎因子密切相关,不同促炎因子之间相互影响,触发并放大炎症反应可加快膝骨关节炎的病情进展,而降低软骨细胞的氧化应激水平、炎症反应和凋亡可有效治疗膝骨关节炎[15-16]。如今中药在膝骨关节炎的治疗中逐渐受到重视,连翘苷作为提取自传统中药连翘的一种天然抗炎剂,可降低促炎因子表达,有效抑制脂多糖诱导的炎症反应[17],能通过改善Th17/Treg免疫平衡减轻肺炎克雷伯菌感染的小鼠肺炎症状[18],还可通过抗炎功效缓解骨关节炎大鼠模型软骨组织损伤[11],本研究以连翘苷处理膝骨关节炎大鼠,发现大鼠关节软骨超微结构受损减轻,关节肿胀度、步态评分和爪压评分、软骨细胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表达降低,表明连翘苷可减少促炎因子合成释放,阻止炎症反应发生,降低凋亡及细胞外基质降解相关蛋白表达,抑制软骨细胞凋亡和结构损伤,改善膝骨关节炎大鼠关节肿胀及功能受损症状,进一步证实了连翘苷对骨关节炎的治疗功效。

MAPK/NF-κB信号可通过调控促炎因子的表达介导骨关节炎的发生发展过程,通过使其信号失活从而抑制炎症的进展,并通过降低MMP3的表达而减轻软骨细胞外基质的降解,最终缓解骨关节炎小鼠的软骨损伤[19],阻断MAPK/NF-κB信号从而下调NLRP3表达,通过减弱炎症反应而减少软骨侵蚀,抑制痛风性关节炎形成及发展[20],还可减轻骨关节炎大鼠软骨细胞衰老、软骨基质降解及关节炎症症状[7],苏娟娟等[8]研究发现连翘苷可抑制牙周炎大鼠p38 MAPK信号活化,进而缓解其牙周组织损伤,因而推测抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信号激活可能是连翘苷治疗膝骨关节炎的药理机制,本研究结果显示,膝骨关节炎大鼠体内MAPK/NF-κB/NLRP3信号处于激活状态,连翘苷可使该信号失活,且以MAPK激活剂C16-PAF处理膝骨关节炎大鼠,可加重其软骨损伤及关节炎症,表明MAPK/NF-κB/NLRP3信号参与介导膝骨关节炎的发生发展及连翘苷对膝骨关节炎大鼠软骨损伤的减轻过程;以连翘苷和C16-PAF联合处理膝骨关节炎大鼠,相比C16-PAF单独处理,可降低NLRP3表达及p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化水平,减轻大鼠关节软骨超微结构受损,降低其关节肿胀度、步态评分和爪压评分、软骨细胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表达,表明连翘苷可减弱C16-PAF对炎症的促进功能,拮抗其对膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡和结构损伤的加重作用,最终逆转C16-PAF对膝骨关节炎大鼠关节功能的损害作用,揭示连翘苷减轻膝骨关节炎大鼠软骨损伤是通过抑制MAPK信号激活实现的。

总之,本研究证实了连翘苷可降低NLRP3表达及p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化,减少促炎因子合成释放,抑制炎症反应,减轻膝骨关节炎大鼠关节肿胀、软骨细胞凋亡及基质降解症状,改善大鼠关节功能,抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信号激活可能是其药理机制之一,本文为连翘苷应用于膝骨关节炎的临床治疗提供了新的理论依据,有助于其在关节炎治疗中的推广应用。