李志鹏 叶眉 李峥 吴刚 张晨 王丽雯 陈辰

[摘要]目的：觀察Beagle犬脂肪干细胞在向成骨细胞分化过程中富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）渗出液的作用，及其与支架材料纳米羟基磷灰石支架生物相容性的实验研究。方法：酶消化法获得Beagle犬脂肪干细胞，将收集的富血小板纤维蛋白渗出液分为成骨诱导矿化液组（含成骨矿化液+5% PRF渗出液）、B组对照组（含成骨矿化液的10% FBS的DMEM）和C组空白组（普通10% FBS的DMEM培养液），观察PRF渗出液对成骨的影响，并用环境扫描电镜观察Beagle犬脂肪干细胞与经PRF渗出液孵育的纳米羟基磷灰石支架复合培养后的附着增殖情况。结果：在PRF渗出液的作用下，脂肪干细胞能够更加有效地向成骨细胞分化，形成更多的钙化结节，结节细小致密。环境扫描电镜观察，脂肪干细胞能在支架上充分地附着伸展。结论：PRF渗出液能够有效促进脂肪干细胞向成骨细胞分化，纳米羟基磷灰石三维支架材料具有很好的生物相容性。

[关键词]富血小板纤维蛋白渗出液；脂肪干细胞；成骨分化；牙周组织工程；纳米羟基磷灰石

[中图分类号]R318.08    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）07-0074-04

Effects of Platelet-Rich Fibrin and Nano-hydroxyapatite/Collagen Scaffold on the Differentiaion of Beagle Adipose-derived Stem Cells， ADSCs into Osteoblastsin Invitro

LI Zhipeng1，YE Mei1，LI Zheng1，WU Gang2，ZHANG Chen3，WANG Liwen4，CHEN Chen4

（1.Department of Stomatology，Anhui No.2 Provincial People's Hospital，Hefei 230041，Anhui，China; 2.Department of Clinical Medicine，Shanghai Smartee Denti-Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China; 3.Department of Stomatology，Anhui Medical College，Hefei 230601，Anhui，China; 4.Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of USTC，Division of Life Sciences and Medicine，University of Science and Technology of China，Hefei 230036，Anhui，China）

Abstract： Objective  To investigate the effect ofplatelet-rich fibrin extract （PRFe） on the diffentiation of Beagleadiposederivedstemcellsintoosteoblast， and to study the biocompatibility with nano-hydroxyapatite scaffolds. Methods  Beagle ADSCs were obtained by enzyme digestion method. Platelette-rich fibrin exudate collected were divided into osteogenic induced mineralization solution group （containing osteogenic mineralization solution+5% PRFe）， control group B （DMEM containing 10% FBS of osteogenic mineralization solution） and blank group C （DMEM medium of normal 10% FBS）. The effect of PRF exudate on osteogenesis was observed， and the attachment proliferation of Beagle dog adipose stem cells and nano-hydroxyapatite scaffold incubated by PRFe were observed by environmental scanning electron microscopy. Results  Under the action of PRF exudate， adipose stem cells can differentiate more efficiently into osteoblasts， more calcified nodules form， and the nodules are small and dense.Environmental scanning electron microscope observation，adipose stem cells can be fully attached and extended on the scaffold. Conclusion  PRFe can effectively promote the differentiation of adipose stem cells into osteoblasts， and nano-hydroxyapatite three-dimensional scaffold material has good biocompatibility.

Key words： platelet-rich fibrin exudate; adipose-derived stem cells; osteoblasts; periodontal tissue regeneration; nano-hap/collagen

牙周組织工程是将体外培养的高浓度、功能相关的组织细胞种植于具有一定空间结构的三维支架载体上，再将此复合物植于牙槽骨的缺损处，诱导牙周组织的修复重建。富血小板纤维蛋白是高浓度的血浆提取物，通过其富含的多种生长因子诱导种子细胞向组织细胞转化，吸引与促进细胞增殖相关的物质聚集和分化的作用[1]。本研究旨在研究Beagle犬脂肪干细胞在向成骨细胞分化过程中富血小板纤维蛋白渗出液的作用及与支架材料—纳米羟基磷灰石/胶原（nano-Hap/Collagen，nHAC）的生物相容性，并观察脂肪干细胞-PRFe-纳米羟基磷灰石/胶原模式在牙周组织再生中的应用潜能。

1  材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：健康纯种雄性1岁Beagle犬3只（购于安徽省阜阳市微光实验动物中心），DMEM培养基（Hylcone，美国）；纳米羟基磷灰石胶原（南京埃普瑞公司）；胎牛血清（Gibco，美国）；I型胶原酶（Sigma，美国）、CD44，CD29（ABZOOM，USA）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、VitC，SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒（上海生工生物）、细胞培养箱、Von Kossa染色试剂盒（南京杰美生物技术有限公司）；荧光倒置显微镜（ZEISS，德国）；平底6孔培养板、平底12孔培养板、平底96孔培养板（Corning，美国）；扫描电镜（Hitachi，日本）。

1.2 Beagle犬脂肪干细胞的分离培养和鉴定

1.2.1 Beagle犬脂肪干细胞的分离培养：取Beagle犬腹股沟处脂肪10 ml，剪除脂肪组织中明显的血管，充分洗涤，加入等体积新鲜配制的1 g/LⅠ型胶原酶，37℃振荡消化30 min，再加入等体积的DMEM培养液（1%青霉素G、1%链霉素）中和，200目筛网过滤后离心（1 000 rpm，5 min）。弃上清且培养液重悬，移至培养瓶中，在37℃，5% CO2的标准环境下培养。24 h后待细胞贴壁首次换液，待细胞铺满瓶底80%～90%，胰酶消化传代或冻存。

1.2.2 Beagle犬脂肪干细胞的鉴定：取生长状态良好的第3代Beagle犬ADSC以1×104个/ml的细胞密度接种在放有载玻片的6孔板中，待细胞铺满孔底70%～80%后取出载玻片，体积分数为4%的多聚甲醛固定20 min，按照SP试剂盒的步骤进行CD29、CD44免疫组织化学染色。

1.3 PRF渗出液的制备：取Beagle犬的静脉血各40 ml，采用离心法制备PRF。以3 000 r/min离心10 min可见3层分层，上层为位于底层的红细胞碎片和位于顶层的淡黄色澄清液体血小板血浆，中层为淡黄色半透明的PRF凝胶层，下层为红细胞碎片层。将采血管上层的血浆层弃去，使用剪刀分离中间层纤维蛋白凝块和下层底部的红血细胞层，获得初级的PRF凝胶，然后将PRF凝胶块置于无菌离心管中，-80℃冰冻1 h，4℃解冻230 g离心10 min，取上清液即为PRF渗出液。

1.4 PRF渗出液对Beagle犬脂肪干细胞向成骨细胞分化的影响：取第3代Beagle犬ADSCs，以1×104/ml接种在12孔板中，待细胞汇合至70%～80%后，更换培养液，实验分为3组。A组成骨诱导矿化液组（含有10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 mmol/L地塞米松和新鲜制备的0.2 mmol/L维生素C的含有10% FBS的DMEM+5% PRF渗出液）、B组对照组（含有10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 mmol/L地塞米松和新鲜制备的0.2 mmol/L维生素C的含有10% FBS的DMEM）和C组空白组（普通10% FBS的DMEM培养液）。

1.5 碱性磷酸酶染色：孵育第7、14、21天，PBS冲洗各组样品2次，0.5% TritonX-100冰上裂解40 min后，将各组细胞裂解液吸入离心管中，4℃离心10 min，并收取各组上清液。向96孔板加入上清样品50 μl、每孔内加入显色底物对硝基苯磷酸酯50 μl，吹打混匀，室温37℃孵育30 min，每孔加入100 μl反应终止液NaOH终止反应，采用酶标仪测定405 nm下的吸光度OD值。绘出标准曲线，根据样品的吸光度值在标准曲线上计算样品的浓度。

1.6 VonKossa钙结节染色：孵育第21天，用PBS洗涤各组样品2遍，浸入1%硝酸银水溶液中10 min，紫外光照射45 min，蒸馏水冲洗洗涤，3%硫代硫酸钠处理5 min，蒸馏水洗涤；1%中性红复染5 min，水洗，晾干，酒精系列脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7 Beagle犬脂肪干细胞与纳米羟基磷灰石/胶原共培养：精确称量支架材料，24孔板10 mg每孔，紫外线消毒2 h，将2 ml PRF渗出液滴加到支架上，37℃孵箱孵育2 h，取第3代Beagle犬ADSCs，以1×104/ml的细胞密度接种，每天倒置相差显微镜观察，每3 d换液，7 d后，2.5%戊二醛固定液固定，置4℃冰箱过夜后环境扫描电镜观察细胞与支架的复合情况。

1.8 统计学分析：计量数据以（x?±s）表示，采用SPSS软件分析处理实验数据，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用配方t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 Beagle犬脂肪干细胞分离培养：倒置显微镜下，Beagle犬脂肪干细胞24 h即能贴壁，刚贴壁的脂肪干细胞大多数呈成长梭形外观，少数呈短梭状，72～96 h贴壁细胞体积增大，呈长梭状，细胞突起相互连接，可汇合呈单层，见图1。传代后，增殖迅速，细胞形态均一，呈长梭状、旋涡状，紧密单层复合生长，各代细胞无明显变化，见图2。

2.2 Beagle犬ADSCs免疫组化鉴定：免疫细胞化学染色显示Beagle犬ADSCsCD44、CD29结果分别见图3A、B，细胞形态均一，约有80%的细胞CD44、CD29染色阳性。

2.3 PRF渗出液对Beagle犬脂肪干細胞向成骨细胞分化的影响

2.3.1 碱性磷酸酶活性检测：细胞内碱性磷酸酶活性是检测细胞成骨诱导能力的一项重要指标，ALP值越高，成骨潜能越大。各组测出吸光值后，代入标准曲线，半定量分析结果显示，复合培养21 d后，A组ALP活性值明显高于B组、C组，两者间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3.2 倒置相差显微镜观察：Beagle犬脂肪干细胞在成骨细胞诱导液中，1周左右能形成零星的钙化结节，而在PRF渗出液的作用下，1周即能形成非常明显的钙化结节，诱导21 d后，细胞形态多呈多角形或短矩形，细胞复层生长更加明显，VonKossa染色可见PRF渗出液组成片的钙化结节形成，结节细小但致密，对照组也有较多的结节形成，但空白组结节较少，见图4。

2.4 Beagle犬脂肪干细胞与纳米羟基磷灰石/胶原共培养：环境扫描电镜下，支架材料为相互交通的多孔状三维立体结构，含大量空隙且空隙相互交通，孔壁间结合状态良好，见图5。对于PRF渗出液-Beagle犬ADSCs/nHA复合物，细胞在材料表面伸展、黏附，形态为梭形或卵圆形，呈聚集性分布，细胞周围有大量基质，见图6。

3  讨论

牙周组织再生是指实现牙槽骨、牙骨质、牙周膜间的再生与功能重建。以细胞为基础的组织工程技术是最可靠的一个替代方法。这种方法主要依靠反应细胞、支持基质和生物反应分子三者之间的相互作用。PRF中生长因子和细胞因子在炎症和伤口愈合中起着关键作用，可作为一种新的生物支材料联合多种促再生方法用于牙周组织再生工程[2]。并有研究表明，在牙周病中PRF还可以用于优化软组织愈合，可以促进归干细胞增殖、分化，共同参与牙槽骨结构的修复[3-6]。在引导性骨再生技术的同时使用PRF，不仅仅有利于牙周手术中组织愈合且对骨缺损也有良好的临床效果，可减少探诊深度[7-8]。有学者发现5%浓度的PRFe体外促进牙龈成纤维细胞的效果最佳，并非随PRF含量的增多越强[9-10]。

三维的微环境对于组织工程来说是非常必要的。随着纳米技术的飞速发展，羟基磷灰石复合生物材料逐渐成为骨组织领域的研究热点[11-12]。研究表明，当羟基磷灰石的尺寸达到纳米级时，其生物复合材料显示出被认为可促进细胞黏附、增殖、分化以及矿物沉积，比纯胶原蛋白支架更高的细胞相容性，更高的机械强度，具有更大的表面积和较高的表面自由能，此特征有利于种子细胞黏附、增殖和迁移[13-14]。通常在口腔科和整形外科手术中作为骨替代材料，以恢复再生受损的骨组织[15]。

实验结果显示，脂肪干细胞-PRFe-纳米羟基磷灰石/胶原支架复合物培养扫描电镜可见，支架内部孔洞内大量细胞生长，细胞完全伸展、形态各异并有细胞基质分泌。一方面它可容纳高密度的细胞，使细胞间形成合适的空间分布和细胞连接，为细胞提供特异性生长和分化信号，另一方面，细胞所分泌的细胞外基质良好的固定在细胞附近，而不易流入细胞液中，并有利于保持细胞特定的形态、代谢、增殖和分化，下一将运用于动物实验模型，实现牙周组织外形、结构和功能的再生，为临床治疗牙周病提供理论基础和科学依据。

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[收稿日期]2022-04-29

本文引用格式：李志鹏，叶眉，李峥，等.富血小板纤维蛋白渗出液对脂肪干细胞成骨分化及纳米羟基磷灰石支架生物相容性的影响[J].中国美容医学，2023，32（7）：74-77.