杨 娜 张月玲 付 燕 温晓英

河北省保定市第一中心医院眼二科，河北保定 071000

糖尿病是常见的慢性疾病，2021 年全球20～79 岁人群糖尿病患病人数达5.37 亿，我国该年龄段人群糖尿病患病人数为1.41 亿，预计到2045 年将增加至1.74 亿，疾病负担居世界首位[1]。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一种微血管并发症，也是导致糖尿病患者致盲的主要原因，严重威胁患者生命质量[2-3]。持续高血糖引起的新生血管形成是DR 发生发展的重要机制[4]。研究表明，微RNA（micro RNA，miRNA）参与DR 发生发展[5]。miR-137 是一种广泛保守的miRNA，有研究分析DR 患者miRNA 表达谱发现，miR-137 是DR 患者异常表达miRNA 之一[6]。缺口受体1（Notch receptorl,Notch1）是一种细胞表面受体，能通过与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、细胞外基质分子等相互作用，直接或间接参与新生血管形成过程[7]。目前关于血清miR-137、Notch1 表达与DR 的关系尚缺乏报道，基于此本研究报道如下，以期为DR 防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021 年1 月至2022 年12 月河北省保定市第一中心医院收治的147 例2 型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）患者为T2DM 组，另选取同期52名健康体检者为对照组。T2DM 组男79 例，女68 例；年龄28～87 岁，平均（61.83±12.28）岁；体重指数18.74～33.30 kg/m2，平均（24.94±3.02）kg/m2；病程2～22 年，平均[9.00（6.00，13.00）]年。对照组男28 例，女24 例；年龄24～82 岁，平均（60.38±11.22）岁；体重指数19.93～28.62 kg/m2，平均（24.27±1.80）kg/m2。两组年龄、体重指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①临床资料完整；②T2DM 符合《中国2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》[8]诊断标准。排除标准：①其他类型糖尿病；②近3 个月急慢性感染；③合并造血、免疫、神经系统损害和恶性肿瘤；④年龄＜18 岁；⑤合并甲状腺、甲状旁腺、肾上腺等其他内分泌疾病；⑥近6 个月免疫抑制剂、激素使用史；⑦既往眼部疾病、先天性弱视、眼内手术史。本研究经医院伦理委员会批准（[2021]055）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清miR-137、Notch1 mRNA 表达检测 采集所有研究对象入院时空腹静脉血3 ml，1 500 g 取上层血清，使用Trizol 法提取总RNA，TaKaRa RNA PCR Kit 试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司，货号：RR024A）合成cDNA。参考试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，货号：DRR041A）说明书进行扩增，miR-137 以U6 为内参校正，Notch1以GAPDH 为内参校正，2-ΔΔCt法计算血清中miR-137、Notch1 相对表达量。miR-137 引物：正向5’-UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG-3’，反向5’-CUACGCGUAUUCUUAAGCAAUAA-3’；Notch1 引物：正向5’-GTTGCATAGGTCCCTCGGTT-3’，反向5’-CGTAGCCAAAGACGAACATGC-3’；U6 引物：正向5’-AGCGCCTTGACCTGGACA-3’，反向5’-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3’；GAPDH 引物：正向5’-GAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC-3’，反向5’-GGAGTTGCTGTTGAAGTCAC-3’。

1.2.2 资料收集 收集T2DM 患者性别、年龄、体重指数、病程、吸烟、饮酒、血压、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹血糖、糖化血红白蛋白（glycosylated hemoglobin albumin，HbA1c）。

1.3 分组方法

参考2019 年美国眼科学会《糖尿病视网膜病变国际临床分级标准》[9]。轻度DR：散瞳眼底检查见微动脉瘤；中度DR：微动脉瘤并伴有轻于重度DR 表现；重度DR：符合以下任意一项。①≥1 个象限有中度的视网膜内微血管异常；②≥2 个象限有静脉串珠样改变；③4 个象限都有严重视网膜内出血和微血管瘤。T2DM 患者入院后根据是否并发DR 分为DR 组45例和非DR 组102 例。DR 分级：参考《糖尿病视网膜病变防治专家共识》[2]将DR 患者分为非增生期组（30例）和增生期组（存在新生血管形成、玻璃体积血、视网膜前出血三项的任一项，15 例）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 28.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，比较采用U 检验。计数资料以例数或百分数表示，比较采用χ2检验。相关性采用Pearson 相关系数分析。T2DM 患者并发DR的影响因素采用多因素logistic 回归分析。预测价值采用ROC 曲线分析，曲线下面积（area under curve，AUC）比较采用Delong 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T2DM 组与对照组血清miR-137、Notch1 mRNA表达比较

T2DM 组血清miR-137 表达高于对照组，Notch1 mRNA 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 T2DM 组与对照组血清miR-137、Notch1 mRNA 表达比较（）

表1 T2DM 组与对照组血清miR-137、Notch1 mRNA 表达比较（）

注T2DM：2 型糖尿病；miR-137：微RNA-137；Notch1：缺口受体1

2.2 T2DM 患者并发DR 的单因素分析

DR 组年龄＞非DR 组，T2DM 病程长于非DR组，FBG、HbA1c、miR-137 高于非DR 组，Notch1 mRNA低于非DR 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 T2DM 患者并发DR 的单因素分析

2.3 DR 患者血清miR-137 与Notch1 mRNA 表达的相关性

Pearson 相关系数分析显示，DR 患者血清miR-137与Notch1 mRNA 表达呈负相关（r=-0.780，P＜0.001）。

2.4 增生期组与非增生期组一般资料和血清miR-137、Notch1 mRNA 表达比较

两组性别、年龄、体重指数和T2DM 病程比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。增生期组血清miR-137表达高于非增生期组，Notch1 mRNA 表达低于非增生期组（P＜0.05）。见表3。

表3 增生期组与非增生期组一般资料和血清miR-137、Notch1 mRNA 表达比较

2.5 T2DM 患者并发DR 的多因素logistic 回归分析

以年龄、T2DM 病程、FBG、HbA1c、miR-137（≥1.47=1；＜1.47=0）、Notch1 mRNA（≥0.98=1；＜0.98=0）为自变量，是否并发DR（是=1；否=0）为因变量，建立logistic回归模型。结果显示，T2DM 病程延长和HbA1c、miR-137≥1.47 为T2DM 患者并发DR 的独立危险因素，Notch1 mRNA≥0.98 升高为独立保护因素（P＜0.05）。见表4。

表4 T2DM 患者并发DR 的多因素logistic 回归分析

2.6 血清miR-137、Notch1 mRNA 表达对T2DM 患者并发DR 的预测价值

ROC 曲线分析显示，血清miR-137、Notch1 mRNA表达联合预测T2DM 患者并发DR 的AUC 大于miR-137、Notch1 mRNA 单独预测（Z=2.265、2.319，P=0.024、0.020）。见表5、图1。

图1 血清miR-137、Notch1 mRNA 表达预测T2DM 患者并发DR 的ROC 曲线

表5 血清miR-137、Notch1 mRNA 表达对T2DM 患者并发DR 的预测价值

3 讨论

T2DM 是胰岛素抵抗或分泌不足所致的代谢性疾病，持续高血糖渗入眼部会阻塞毛细血管和引发局部炎症反应、氧化应激及缺血缺氧，增加血-视网膜屏障通透性和促进新生血管形成，引起视网膜神经细胞结构和功能改变甚至完全丧失功能[10-11]。DR 不仅会严重损害糖尿病患者视力，还会增加心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病和全因死亡风险[12-13]，同时视力受损和丧失也会严重影响患者心理健康[14]。DR 患者每年进展为威胁视力的增生期DR 发生率为3.4%～12.3%，尽管手术、激光、玻璃体腔注射药物治疗能改善视力，但视力恢复并不如意且复发率较高[15]。

研究显示，miRNA 能通过调控炎症反应、氧化应激、新生血管形成等多种机制参与DR 的发生发展[4，16]。miR-137 定位于人染色体1p21.3，马欢临等[17]报道，miR-137 能靶向白细胞介素-6 增强高糖诱导的胎盘滋养细胞炎症反应。Shu 等[18]报道，miR-137 能靶向Y染色体性别决定区-盒转录因子促进高糖诱导的人系膜细胞氧化应激和炎症。Peng 等[19]报道，上调miR-137 可导致高糖诱导的人脐静脉内皮细胞功能障碍，促进新生血管形成和增加血管通透性。本研究结果显示，T2DM 患者血清miR-137 表达上调，miR-137≥1.47 是DR 发生的独立危险因素，这与近期Dos 等[6]报道miR-137 在DR 患者中升高结果相符。提示，miR-137 表达上调会增加DR 风险，分析原因可能是miR-137 表达上调能导致视网膜微血管内皮细胞功能障碍，导致视网膜微血管内皮细胞炎症反应和氧化应激，并刺激新生血管形成，进而导致DR 发生[17-19]。

T2DM 患者视网膜组织因炎症、氧化应激、缺血缺氧等引起的血管病变会促使新生血管形成，其较薄的管壁极易破裂出血（即眼底出血），模糊视力的同时血管破坏后形成的瘢痕组织会牵拉视网膜，导致视网膜破坏甚至脱落，最终引起失明[4]。Notch 信号通路是一条高度保守的信号通路，能通过与锯齿状典型Notch 配体、Delta 样配体（Delta like ligand，DLL）1、DLL4的相互作用，直接或间接参与血管新生调控，该信号通路缺失将导致严重的血管缺陷[20]。Notch1 是Notch信号通路中主要表达受体蛋白，DLL4 是其公认的受体，DLL4/Notch1 信号通路激活可抑制VEGF 介导血管内皮细胞增殖、迁移和新生血管形成等过程[21]。Notch1蛋白在糖尿病小鼠视网膜内低表达，并随着葡萄糖浓度增高而降低。本研究结果显示，T2DM 患者血清Notch1 mRNA 表达下调，Notch1 mRNA≥0.98 是DR发生的独立保护因素，这与以下研究报道结果相符[22-23]，分析其机制可能是Notch1 mRNA 上调能激活DLL4/Notch1 信号通路，抑制新生血管形成[24]。本研究也发现miR-137 与Notch1 mRNA 表达在DR 患者血清中表达呈负相关，提示二者可能共同参与DR 发生发展。近期研究[25-27]亦证实，下调miR-137 能靶向上调Notch1，能阻止DR 发生。本研究结果还显示，增生期组血清miR-137 表达进一步升高，Notch1 mRNA 表达进一步降低，提示，miR-137 表达高表达和Notch1 mRNA 低表达还可能促进DR 进一步发展，分析原因可能是miR-137 表达上调和Notch1 mRNA 表达下调能促进新生血管形成，破裂后形成瘢痕组织牵拉视网膜结构导致视网膜前出血、玻璃体积血等增生型DR改变。

此外，本研究结果还显示，T2DM 病程延长和HbA1c升高会增加T2DM 患者并发DR 风险，分析原因是T2DM 随着病程延长，血糖控制不佳率升高，因此DR 风险增加；HbA1c是评估血糖控制情况的重要指标，HbA1c升高反映血糖控制不佳，因此DR 风险增加[28]。最后本研究通过绘制ROC 曲线发现，miR-137 联合Notch1 mRNA 预测T2DM 患者并发DR 的AUC 较miR-137、Notch1 mRNA 单独预测的AUC 显著增加。提示，血清miR-137、Notch1 mRNA 表达可能成为DR辅助预测指标，且二者联合能提升DR 预测价值。

综上所述，T2DM 患者血清miR-137 表达升高，Notch1 mRNA 表达降低，二者可能共同参与DR 发生，可能成为DR 辅助预测指标，且二者联合能提升DR预测价值。但本研究还需前瞻性多中心研究验证。