王旭东, 吴昊书, 王作亮, 李秋月, 王俊龙,2, 张 继,2, 梁俊玉,2

(西北师范大学生命科学学院1,兰州 730070)

(西北师范大学新农村发展研究院2,兰州 730070)

赤拟谷盗Triboliumcastaneum和烟草甲Lasiodermaserricorne是2种仓储害虫,分布于世界各地。赤拟谷盗现已成为我国大型粮仓中的优势害虫种群,其食性广,可危害谷物、油粮、食用菌、中药材、动物性产品及加工产品等,从而造成严重的经济损失[1]。烟草甲具有适应能力强、食性广泛,主要危害储存的谷物、香料和中药材料等,也可危害储存过程中的烟叶及卷烟制品,造成较为严重的经济损失[2-4]。植物线虫是引起我国农作物病害的重要病原物之一,是严重危及我国小麦、玉米、水稻、甘薯、马铃薯、大豆、蔬菜、花生、中草药等粮食和经济作物安全生产的重要病害[5]。马铃薯茎线虫Ditylenchusdestructor作为植物线虫的一种,寄主分布广泛,可侵染危害包括马铃薯、甘薯、豌豆、花生和玉米等粮油作物[6,7]。

赤拟谷盗、烟草甲和马铃薯茎线虫的防控主要依赖于化学杀虫剂,其长期使用使得害虫产生耐药性,而且使用后的药剂残留对食品安全、人类健康和生态环境产生了极大的影响[8-10]。因此,寻找绿色、安全和高效的新型杀虫剂至关重要。近年来,因为许多植物次生代谢物具有触杀、拒食、趋避、拒产卵和生长发育等生物活性,而且还具有高效、低毒、安全等优点,植物源提取物已成为新型绿色农药开发的研究重点[11,12]。张红建等[13]报道了麻疯树、山苍子和山苦楝95%乙醇粗提物对赤拟谷盗表现出较强的驱避性和触杀性。赵海刚等[14]报道了巴豆乙醇提取物、巴豆丙酮提取物、巴豆乙酸乙酯提取物等对烟草甲成虫有较好的触杀毒力。闫磊等[15]报道了银杏甲醇提取物对马铃薯茎线虫具有很高的毒杀活性。

千里香杜鹃Rhododendronthymifolium为杜鹃花科杜鹃花属常绿直立小灌木, 高0.3～1.3 m。其生于海拔2 400～4 800 m的湿润阴坡或半阴坡、林缘或高山灌丛中, 产于甘肃、青海、四川等地[16,17]。研究发现,千里香杜鹃挥发油及其单萜类化合物吉马酮对赤拟谷盗、嗜卷书虱、烟草甲均有较强的毒杀活性[18,19]。千里香杜鹃中多种单萜类化合物也被报道具有杀虫、杀菌、抗病毒活性[20,21]。目前对千里香杜鹃的抗虫活性的研究报道多集中于其挥发油和挥发性成分单萜、二萜类化合物中,鲜有千里香杜鹃枝、叶粗提物对赤拟谷盗和烟草甲的触杀、熏蒸活性研究,也鲜有千里香杜鹃对赤拟谷盗和烟草甲的拒食活性研究以及对马铃薯茎线虫的毒杀活性研究。所以本实验研究了千里香杜鹃枝、叶经不同溶剂(石油醚、甲醇、95%乙醇)提取得到的物质对赤拟谷盗和烟草甲的触杀、熏蒸和拒食作用以及对马铃薯茎线虫的毒杀作用,初步筛选出对赤拟谷盗、烟草甲和马铃薯茎线虫具有较好生物活性的提取物和有效抗虫活性的部位,为千里香杜鹃防治赤拟谷盗、烟草甲和马铃薯茎线虫以及发展粮油作物生态种植和绿色仓储提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

千里香杜鹃样本于2021年8月采自甘肃省天祝县石门镇(东经36°58′58″,北纬102°54′04″,海拔2 765 m)。植物学名经西北师范大学生命科学学院梁俊玉副教授鉴定。样本自然阴干,存放于实验室。

1.2 供试虫源

1.2.1 赤拟谷盗和烟草甲

将赤拟谷盗和烟草甲饲养在容积为0.5 L的玻璃瓶中,以10 ∶1质量比混合的小麦粉与酵母粉进行饲养。培养温度28～30 ℃,相对湿度为70%～80%。实验昆虫(试虫)为羽化后1～2周的成虫,不区分雌雄。

1.2.2 马铃薯茎线虫的培养

马铃薯茎线虫由西北师范大学生命科学学院中药质量研发与产品开发实验室提供,经西北师范大学生命科学学院周峰老师鉴定确认。用培养有灰葡萄孢的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行马铃薯茎线虫的培养。培养温度为25 ℃,相对湿度80%～90%。实验试虫为培养15 d左右的线虫。

1.3 提取物制备实验方法

称取粉碎后的千里香杜鹃植物样品枝、叶粗粉各约30 g,用石油醚(沸程：60～90 ℃)、体积分数95%乙醇、甲醇微沸回流提取2次,2次的料液比分别为1∶10和1∶8;提取时间分别为1 h和50 min。合并滤液,减压抽滤,滤液经旋转蒸发、浓缩,得到植物提取液浸膏。然后将经石油醚提取后的枝、叶晾干,分别加入甲醇,用同样的方法,即可得到脱脂枝甲醇提取物和脱脂叶甲醇提取物,再对所得提取物进行称量,分别计算出膏率。出膏率=m(浸膏)/m(样品)×100%。最后,将所得提取物浸膏置于4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.4 活性测试实验方法

1.4.1 赤拟谷盗和烟草甲触杀活性测试

采用点滴法[22],从饲养的试虫中各挑选10头健全的活性较好且大小一致的成虫(不分雌雄),将其置于活性测试玻璃瓶(高5.5 cm,直径2.5 cm)中。用丙酮稀释待测液,得到5个浓度梯度。首先将试虫置于培养皿盖内,用冰袋将试虫麻痹,用移液器移取0.5 μL待测样品的丙酮稀释液,将其滴于试虫的前胸背板,再将试虫尽数装入各自测试玻璃瓶,置于温度28～30 ℃,相对湿度(75±5)%的培养箱中培养。以除虫菊脂为阳性对照,丙酮为阴性对照。每个浓度均重复5次,每次均10头试虫,24 h后观察和记录试虫死亡/存活情况。利用SPSS V22.0软件统计分析计算半致死剂量LD50。

1.4.2 马铃薯茎线虫毒杀活性测试

参照文献[23],将待测样品用5%吐温-80和2%DMSO水溶液配制成一定浓度的待测样品稀释液。通过预实验确定合适的测试浓度范围。将10 μL马铃薯茎线虫悬浮液(约100 条线虫)和90 μL不同浓度的待测样品稀释液置于96孔细胞培养板中,置于温度25 ℃,相对湿度(85±5)%的培养箱中培养,每组处理重复5次。以克百威为阳性对照,等体积的5%吐温-80和2%DMSO为阴性对照,24 h后观察记录各组线虫的死亡/存活情况。利用SPSS V22.0软件统计分析计算半致死浓度LC50。

1.4.3 赤拟谷盗和烟草甲熏蒸活性测试

参照文献[24],从饲养的试虫中各挑选10头健全的活性较好且一致的成虫(不分雌雄),将其置于活性测试玻璃瓶(高5.5 cm,直径2.5 cm)中。用丙酮稀释待测液,得到5个浓度梯度。用移液器移取10 μL待测样品的丙酮稀释液,将其滴加到测试玻璃瓶盖内的约为2 cm2的圆形滤纸片上,待溶剂挥发20 s后迅速盖紧瓶盖并封口形成密闭空间,置于温度28～30 ℃,相对湿度(75±5)%的培养箱中培养。赤拟谷盗和烟草甲分别以甲基溴和磷化氢为阳性对照,丙酮为阴性对照。每个浓度均重复5次,每次均20头试虫,24 h后观察和记录试虫死亡/存活情况。利用IBMSPSS V22.0软件统计分析计算半致死浓度LC50。

1.4.4 赤拟谷盗和烟草甲拒食活性测试

参照文献[25]的研究方法并进行改进,称取0.8 g小麦粉,吸取不同体积的待测样品液加80%乙醇稀释,最后定容至2 mL,摇匀后加入小麦粉中,搅拌均匀,配制成不同浓度的小麦粉混浊液。对照组用2 mL体积分数80%乙醇与小麦粉混匀。将移液枪的枪头切去部分,取200 μL小麦粉混浊液于培养皿上形成面饼,置于通风橱中过夜,再置于温度29～30 ℃,相对湿度(75±5)%的培养箱中平衡水分后形成拒食测试面饼。挑选20头试虫于计数瓶中,将试虫饥饿24 h。称量空瓶质量,加入面饼后称质量,然后加入20头试虫再称质量,最后拧紧瓶盖,将处理组与对照组的计数瓶置于恒温培养箱中培养。培养3 d后,先称总瓶质量,然后将试虫取出,称取面饼和瓶的总质量,计算试虫取食量,处理组每个浓度重复5次。拒食率计算公式：拒食率FDI=(C-T)/C×100%,其中C为对照组面饼消耗量;T为处理组面饼消耗量。将拒食率值转换为反正弦平方根值,采用SPSS V22.0进行ANOVA单因素方差分析(Tuckey’s HSD test),比较拒食均值之间的差异。当P<0.05 时,认为均值之间存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物得率

千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物得率见表1。千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物中出膏率最高的为脱脂叶甲醇提取物,得率为29.09%,其次叶95%乙醇提取物和脱脂枝甲醇提取物,得率分别为27.33%、26.32%。枝、叶甲醇提取物和枝95%乙醇提取物的出膏率均在10%～20%之间。枝、叶石油醚提取物的出膏率最低,均低于10%。

表1 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物质出膏率

2.2 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗的触杀活性

千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗的触杀活性实验结果见表2。千里香杜鹃枝、叶95%乙醇提取物对赤拟谷盗表现出较强触杀活性,其LD50分别为19.10、15.32 μg/头。文献[26-28]报道柳叶亚菊挥发油、千里香杜鹃挥发油、头花杜鹃挥发油、毛莲蒿挥发油、鸡骨柴挥发油对赤拟谷盗的触杀活性LD50分别为64.51、29.82、104.92、30.63、26.64 μg/头,与这些采用相同测试方法的植物挥发油对赤拟谷盗的触杀活性相比,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物具有较强的触杀活性,而且触杀活性明显高于其他6种提取物,约为石油醚提取物活性的4倍,但与阳性对照相比具有一定差距。

表2 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗的触杀活性

2.3 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对烟草甲的触杀活性

千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对烟草甲的触杀活性实验结果见表3。结果表明,脱脂枝甲醇提取物和枝、叶95%乙醇提取物对烟草甲表现出较好的触杀活性,其LD50分别为28.81、31.08、16.18 μg/头。柳叶亚菊挥发油、千里香杜鹃挥发油、头花杜鹃挥发油对烟草甲的触杀活性LD50值为25.66、29.15、44.40 μg/头[26-28],与采用相同测试方法的植物挥发油对烟草甲的触杀活性相比,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物具有较强的触杀活性。虽然对比阳性对照活性有一定差距,但触杀活性约为枝、叶石油醚提取物的5.7、10.3倍,这与本研究中千里香杜鹃叶95%乙醇提取物对赤拟谷盗的触杀活性测试结果具有一致性。

表3 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对烟草甲的触杀活性

2.4 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对马铃薯茎线虫的毒杀活性

千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对马铃薯茎线虫的毒杀活性实验结果见表4。枝、叶95%乙醇提取物和枝、叶甲醇提取物对马铃薯茎线虫表现出较好的毒杀活性,LC50分别为0.78、0.83、1.24、1.02 mg/mL,其中叶95%乙醇提取物表现出显著毒杀活性,文献[29-30]报道丝裂亚菊挥发油、光苞亚菊挥发油、铺散亚菊挥发油和银杏甲醇提取物对马铃薯茎线虫的毒杀活性LC50分别为1.50、1.23、3.83、5.12 mg/mL。与这些采用相同测试方法的植物挥发油和植物提取物对马铃薯茎线虫的毒杀活性相比,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物具有较强的毒杀活性,与阳性对照克百威相比,其活性弱于阳性对照,但相比于其他6种提取物具有一定的优势。

表4 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对马铃薯茎线虫的毒杀活性

2.5 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗和烟草甲的熏蒸活性

千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗和烟草甲的熏蒸活性实验结果见表5和表6。各提取物均对赤拟谷盗和烟草甲表现出较弱熏蒸活性。推测可能是因为熏蒸是可挥发性化合物在密闭环境中杀死害虫的一种作用方式,而实验中的植物不同溶剂的提取物不具有挥发性气味,因此导致不同提取物对害虫的熏蒸效果较弱。

表5 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗的熏蒸活性

表6 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对烟草甲的熏蒸活性

2.6 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗的拒食活性

千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗和烟草甲拒食活性实验结果见表7和表8。千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗和烟草甲均表现出不同程度的拒食活性,且具有浓度依赖性,即随着测试浓度升高,拒食活性变高,这与一般农药的作用特点相符合[32]。其中,95%提取物在各测试质量浓度下均对赤拟谷盗表现出较好的拒食活性,其拒食率在测试质量浓度范围内为32.54%～78.17%。在质量浓度2.0 mg/mL测试条件下,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物对赤拟谷盗表现出较好拒食活性,拒食率为78.17%,与阳性对照昆虫拒食剂川楝素相比具有相近的拒食活性。

表7 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对赤拟谷盗的拒食活性

表8 千里香杜鹃枝、叶不同溶剂提取物对烟草甲的拒食活性

千里香杜鹃枝、叶95%乙醇提取物在各测试质量浓度下均对烟草甲表现出较弱的拒食活性,在质量浓度2.0 mg/mL测试条件下的拒食率为 46.12%、48.12%。千里香杜鹃叶95%乙醇提取物对赤拟谷盗和烟草甲均表现出拒食活性,并且8种提取物在各个测试质量浓度下对赤拟谷盗的拒食活性明显强于烟草甲,可能是因为2种仓储害虫对各提取物的敏感性不同,引起各提取物间的拒食活性存在不同。

因此,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物对赤拟谷盗(LD50=15.32 μg/头)、烟草甲(LD50=16.18 μg/头)和马铃薯茎线虫(LC50=0.78 mg/mL)表现出较强触杀和杀线虫活性;另外,在质量浓度2.0 mg/mL测试条件下,对赤拟谷盗也表现出较好拒食活性,拒食率为78.17%。说明同一植物的不同部位(千里香杜鹃枝和千里香杜鹃叶)、不同溶剂提取物的抗虫活性存在差异,其中95%乙醇从千里香杜鹃叶提取到的活性成分中含有较多能抑制赤拟谷盗、烟草甲和马铃薯茎线虫活性的有效成分。植物中的杀虫活性物质主要是植物次生代谢物质,而乙醇是较强的极性溶剂,对植物中的次生代谢物质有较强的溶解性,能够更有效的提取到植物次生代谢物质。这与张红建等[13]报道的麻疯树、山苍子和山苦楝的95%乙醇粗提物对赤拟谷盗具有较强的生物活性这一研究结果一致。司爱富等[34]指出乙醇为亲水性有机溶剂,大多物质能在乙醇中溶解,亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大,乙醇提取物中可能含有鞣质等多羟基的衍生物, 有机酸盐、生物碱盐及亲水性比较强的苷类物质。植物挥发油的主要成分是一些弱极性的化合物,通常可被乙醇提出,所以在千里香杜鹃叶95%乙醇提取物可能含有一些挥发性成分,而在此前,从千里香杜鹃叶挥发油中鉴定出14种化合物,并用挥发油及其主要成分吉马酮做了对赤拟谷盗和烟草甲的触杀活性测试(LD50分别为29.82、0.97、29.15、17.18 μg/头),发现吉马酮对赤拟谷盗表现出较好触杀活性(LD50=0.97 μg/头),但千里香杜鹃叶挥发油触杀活性都明显低于此次千里香杜鹃叶95%乙醇提取物触杀活性,推测可能是叶95%乙醇提取物中存在的非挥发性成分或者是非挥发性成分与挥发油中的一些弱极性的化合物复配产生了有效抗虫活性,但究竟是提取物中哪种成分起到有效抗虫效果,还需要进一步的分离纯化及鉴定研究其发挥作用的活性物质,以期得到可对粮油作物种植和储藏害虫进行有效且高效防控的活性化合物。另外,本实验中只测试了对赤拟谷盗和烟草甲成虫的抗虫活性,而对其幼虫和卵的抗虫活性也还需进一步实验。

3 结论

分析千里香杜鹃枝、叶经不同溶剂(石油醚、甲醇、95%乙醇)提取得的物质对仓储害虫(赤拟谷盗、烟草甲)的触杀、熏蒸和拒食活性以及其对马铃薯茎线虫的杀线虫活性。结果表明,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物对赤拟谷盗、烟草甲和马铃薯茎线虫具有明显杀虫活性;对赤拟谷盗具有明显拒食活性,与阳性对照拒食活性相近。在本实验中,尽管与阳性对照相比,千里香杜鹃叶95%乙醇提取物并未表现出更好抗虫活性,但与其他文献中报道的运用类似生物测定方法的植物挥发油相比,其对赤拟谷盗、烟草甲和马铃薯腐烂茎线虫表现出更明显或相近的杀虫活性,并且植物提取物作为植物源杀虫剂,具有低毒、易提取、绿色环保等优势。