刘 影，张 睿，杨 雪，邓加加，徐 锋，2

(1 贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550000；2 贵州中医药大学薏苡仁资源与开发研究中心，贵州 贵阳 550000)

薏苡仁为禾本科植物薏苡Coixlacrma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁，现代研究表明，薏苡仁除了能够降血糖、抗炎镇痛、调节肠胃和机体免疫功能外，其主要的化学成分更是包含有抗肿瘤、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、镇痛、抗氧化等活性成分[1-6]，在临床上对多种恶性肿瘤、妇科疾病、各种炎症、免疫力低下等具有明显的治疗作用[7]。因此，对于薏苡仁药材化学成分的研究也在不断的深入当中。关于薏苡仁酯类成分的抗肿瘤作用研究，最早出现在1961年，英国学者从薏苡仁中第一次分离出薏苡仁酯并推测其为薏苡仁抗肿瘤的主要化学成分[8]，后面陆续从薏苡仁中分离出的无羁萜、白茅素、圣草素等也使得薏苡仁药材发展更进一步[9-10]。

对于薏苡仁质量控制方面的技术大都采用分光光度法、红外光谱法、色谱法、生物效价法等[11-14]。关于中药材或中药制剂的优劣评价、真伪鉴别、物种区分方面的相关技术，普遍采取中药指纹图谱，该法是一种综合的、可量化的鉴定手段，能够较大程度的保证中药材、中药制剂等在质量控制研究当中的优良性、真实性、稳定性、一致性等。目前针对薏苡仁的相关文献关注点都主要集中在脂溶性成分，而少有对薏苡仁药材整体质量的一个控制、评价和比较。本研究将针对黔产野生和家种薏苡仁药材建立HPLC指纹图谱，意在通过指纹图谱分析比较两者之间的一个差异，用于二者之间的鉴别，以期为二者临床用药提供参考。

1 材 料

1.1 仪 器

高速粉碎机，浙江屹立工贸有限公司；JP2-160电子天平，日本；药匙；称量纸；具塞锥形瓶；玻璃漏斗；滤纸，杭州富阳北木浆纸有限公司；蒸发；DHS0260超声波清洗机，天津奥泰；HH-6数显恒温水浴锅，常州越新仪器制造有限公司；玻璃棒；2 mL容量瓶；一次性注射器；0.22 μm有机相滤；高液小瓶；Waters高效液相色谱仪(E2695)。

1.2 试剂与药材

分析冰醋酸，重庆川东化工有限公司；色谱甲醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；色谱乙腈，天津市科密欧化学试剂有限公司；哇哈哈纯净水；薏苡素对照品(批号：J26GB152842)、甘油三油酸酯对照品(MUST-2008 2001)，上海源叶生物科技有限公司；10批市面收集的产地贵州的薏苡仁；10批采自贵州的野生薏苡仁。具体来源见表1和表2。

表2 黔产家种薏苡仁药材来源

1.3 薏苡仁药材的产地来源

实验所用的野生和家种薏苡仁均来自于贵州省的几个不同产地，经鉴定详细情况见表1，表2。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters Diamonsil Plus 5 μm C18(250 mm×4.6 mm)色谱柱，乙腈(A)-0.05%乙酸水 洗脱系统梯度洗脱(0～40 min，5%～30%A；40～55 min，30%～40%A；55～65 min，40%～70%A；65～85 min，70%～100%A；85～87 min，100%～5%A)，流速0.1 mL·min-1，柱温设置为30 ℃，检测波长254 nm，进样量为20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

精密称定薏苡仁样品粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇，超声提取0.5 h，滤过于蒸发皿中，置65 ℃水浴锅上挥干，挥干剩下物质加甲醇溶解并定容至2 mL，用有机相微孔滤膜(0.22 μm)滤过，取续滤液1.5～2 mL于高液小瓶中，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取薏苡仁供试品溶液，按“2.1”项下给出的色谱方法连续进样6次，记录色谱图，以13号峰为参照峰，测得共有峰与参比峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取薏苡仁药材6份，按“2.2”项下的操作制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，测得其各共有峰与参比峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

按“2.1”项下方法分别在0、4、8、16、32、64 h进样，测定薏苡仁供试品溶液，其各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明样品溶液在室温下64 h内稳定，足以满足稳定性要求

2.4 指纹图谱的建立

按“2.1”项下色谱条件测定10批黔产家种薏苡仁样品与10批黔产野生薏苡仁样品，根据检测结果建立薏苡仁的UPLC指纹图谱，见图1、图2、图3和图4。家种薏苡仁选择了以保留时间约32.851的峰为参照峰S，共确立了26个共有峰；野生薏苡仁选择了以保留时间约24.637的峰为参照S，确立了23个共有峰。并对各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行了计算，见表3和表4。

图1 10批黔产野生薏苡仁的HPLC对照指纹图谱

图2 10批黔产野生薏苡仁的HPLC对照指纹图谱

图3 10批黔产家种薏苡仁的HPLC对照指纹图谱

图4 10批黔产家种薏苡仁的HPLC指纹图谱

表3 10批野生薏苡仁药材UPLC指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 10批野生薏苡仁药材UPLC指纹图谱共有峰相对面积

2.5 相似度评价

将收集的10批黔产家种薏苡仁和10批黔产野生薏苡仁药材的图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件，进行相似度的评价，具体相似度见表5和表6。

表5 10批家种薏苡仁药材UPLC指纹图谱共有峰相对保留时间

表6 10批家种薏苡仁药材UPLC指纹图谱共有峰相对面积

在对收集到的10批黔产家种和10批黔产野生薏苡仁药材的HPLC指纹图谱实验结果表明，10批黔产家种薏苡仁的相似度在0.852～0.994，10批黔产野生薏苡仁的相似度为0.808～0.983。从二者的指纹图谱中可以明显的看出二者指纹图谱的不一样，其中就包括二者共有峰的个数和分布情况。

3 讨 论

3.1 提取方式的考察

在对薏苡仁的处理上，分别采用了乙腈-二氯甲烷(65∶35)、石油醚、乙酸乙酯和甲醇作为溶剂，利用超声和回流的提取方式，结果表明，在用甲醇作为提取溶剂，超声30 min的条件下，对药材中各成分的提取效果较好，且色谱峰的数量也较多。

3.2 色谱条件的考察

本研究依次对甲醇-水、乙腈-0.05%乙酸水和甲醇-0.05%乙酸水等流动相系统进行了考察，发现在乙腈-0.05%乙酸水的条件下其每个峰的分离度较好。考察不同的流速(0.8、1.0 mL·min-1)和柱温(25、30 ℃)对色谱峰分离度的影响，发现流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃的色谱峰分离度良好。

3.3 检测波长的选择

按“2.1”色谱条件对黔产家种和野生薏苡仁进行了多波长扫描检测，结果发现，在254 nm波长处，各峰的分离度良好，基线较平稳，吸收较大且所出的峰个数较多，特此选择254 nm作为检测波长。

3.4 黔产家种和野生薏苡仁的差异

本研究分别建立了10批黔产家种和10批黔产野生薏苡仁药材的HPLC指纹图谱，结果表明10批黔产家种薏苡仁的相似度在0.852～0.994，10批黔产野生薏苡仁的相似度为0.808～0.983，二者各自的相似度均较高。对黔产野生薏苡仁和家种薏苡仁指纹图谱进行比较，可以明显发现两者的色谱峰个数和共有峰峰面积均存在较大差异，家种的共有峰为26个，野生的则只有23个，在整体共有峰的分布上来说，家种薏苡仁的共有峰以保留时间60 min为界，在保留时间60 min后仍发现约11个共有峰出现，且分布较密集，峰面积亦较大，野生薏苡仁在约60 min所出现的峰则只有4个，且分布较均匀，峰面积较前者亦更小。我们推测黔产野生薏苡仁相较于黔产家种薏苡仁来说，其药材内共有成分较少，可能与其生长环境有较大的联系。由上可知HPLC液相指纹图谱可用于黔产野生和家种薏苡仁的识别，可为两者的深入研究提供一定的参考。