林莺 张荣东 陈仁利 陈琦

宁德师范学院附属宁德市医院血液科，宁德 352100

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种获得性造血干细胞克隆缺陷性疾病。目前，关于PNH 克隆如何取得增殖优势的机制还不清楚，免疫机制、抗凋亡机制、二次基因突变或异常表达机制以及微环境改变均可在其中发挥重要作用［1-2］。Heeney等［3］发现一些抗凋亡基因在PNH 患者中有明显的高表达，抗凋亡基因上调可能导致PNH 和相关疾病凋亡抵抗，这也提示了凋亡机制参与PNH 克隆的增殖。本研究主要探讨Mcl-1 基因异常表达在PNH 克隆增殖中的抗凋亡作用，现报道如下。

资料与方法

1.一般资料

选取2020年2月至2022年2月在宁德师范学院附属宁德市医院住院或门诊就诊的PNH患者13例，其中男7例，女6 例，中位年龄27（21，56）岁；对照组为同期健康体检者15例，且经PNH Flaer检测未检测出PNH 克隆，其中男8例，女7 例，中位年龄38（23，67）岁。病例组与对照组在性别、年龄等一般资料方面比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。纳入标准：既往确诊或新诊断的PNH 患者，PNH 克隆阳性，无自身免疫性疾病病史、近期无感染史，PNH 诊断符合国内统一标准［4］。排除标准：PNH 克隆阴性存在自身免疫性疾病或近期有严重感染者。

本研究通过宁德师范学院附属宁德市医院医学伦理委员会批准（审查编号：20200318），受试者均知情同意并签署知情同意书。

2.主要试剂和仪器

藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人CD59 单抗、抗PE 的免疫磁珠、MS 分选柱均为美国Becton Dickinson 公司；Ficoll-Paque 分离液、磁珠缓冲液、凋亡试剂盒、Trizol RNA Reagent、逆转录试剂盒等均购于美国Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式细胞仪为美国Becton Dickinson 公司产品；PCR仪器为日本Takara公司。

3.实验步骤

（1）标本的采集和处理：采集PNH患者及对照组的骨髓液10 ml，使用Ficoll-Paque 分离液提取骨髓中单个核细胞，并洗涤后重悬细胞。在PNH患者的骨髓单个核细胞中先后加入抗CD59 抗体及抗PE 的免疫磁珠，用分选柱行磁珠分选细胞，得到CD59-细胞及CD59+细胞。使用流式细胞术检测磁珠分选后CD59-及CD59+比例，其中CD59-细胞纯度达96% 以上。（2）CD59-细胞的培养和处理：将分选出的CD59-细胞用培养基定容并计数细胞，并将细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养。将PNH 患者CD59-细胞接种于6 孔板，每孔2×105细胞，并用lipofectamin2000 转染细胞，分为3 组，分别为转染Mcl-1 siRNA 组（siRNA-Mcl-1 转染组）、转染无义序列组（siRNA-scr 转染组）和空白对照组，转染后检测各组细胞的增殖、凋亡及细胞周期分布等生物学变化。（3）RT-PCR 检测各组细胞Mcl-1 基因mRNA 的表达：各组细胞分别提取总RNA，然后进行RNA 纯度测定，同时使用紫外分光光度计测OD260∕280的比值，要求吸光度OD260∕280>1.8，然后进行RNA 逆转录，获得各组的cDNA，行PCR 扩增检测，各引物由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成，并按比例配制反应体系，最后计算机分析获得样本及内参的Ct值后行数据处理。（4）MTS法检测各组细胞增殖情况：收集各组细胞以适当密度接种于96 孔板中，37 ℃ 5% CO2培养箱培养，培养终止前3 h 加入20 µl MTS，3 h 后，振荡器振荡10 min，酶标仪490 nm 检测OD 值。（5）检测细胞凋亡率：转染培养24 h、48 h、72 h后，收集各组细胞，调整适当细胞密度为1×106∕ml，用流式细胞仪以AnnexinV∕PI 双染法检测各组细胞的凋亡率。（6）流式检测细胞周期分布情况：转染培养后，收集各组的CD59-细胞，用PBS 洗涤并重悬细胞，按照操作说明，依次加入ABC 液，过滤后收集滤液上机检测。

4.统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验，计数资料以例（%）表示，组间比较采用Fisher确切概率法，P<0.05示差异有统计学意义。

结果

1.患者特征（表1）

表1 13例阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者的基本临床特征

13 例PNH 患者中表现为骨髓衰竭型患者4 例、经典型PNH 患者9 例，两者在性别、年龄、CD59-、CD55-、网织红细胞绝对值（Ret）方面比较差异均无统计值意义（均P>0.05）。

2.PNH 患者CD59-细胞Mcl-1 基因mRNA 的表达量（图1）

图1 使用流式细胞术检测13例阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者标本磁珠分选后CD59-（A）、CD59+（B）比例

使用流式细胞术检测PNH 患者标本磁珠分选后CD59-及CD59+比例，其中CD59-细胞纯度达96%以上；PNH患者CD59-细胞组、CD59+细胞组、对照组的Mcl-1基因mRNA的表达量分别为（2.48±0.25）、（1.61±0.19）、（1.21±0.08），CD59-细胞组均高于CD59+细胞组及对照组（P=0.031、0.022），而CD59+细胞组和对照组间比较差异无统计学意义（P=0.126）；同时，PNH 患者Mcl-1 基因mRNA 的相对表达量与CD59-克隆细胞数呈正相关（r2=0.523，P=0.012）。

3.沉默Mcl-1基因效果的验证

PNH 患者CD59-细胞转染靶向siRNA-Mcl-1 后，Mcl-1 mRNA 表达水平下降，siRNA-Mcl-1 转染组Mcl-1 mRNA 表达量为（1.05±0.07），低于siRNA-scr 转染组的（1.87±0.21）和空白对照组的（1.49±0.11），差异均有统计学意义（P=0.038、0.046）。

4.细胞增殖率检测（图2）

图2 siRNA-Mcl-1转染后13例阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者CD59-细胞各组不同时间点的增殖情况

MTS 法检测siRNA-Mcl-1 转染前后PNH 患者CD59-细胞的增殖情况，结果提示Mcl-1基因沉默后CD59-细胞增殖率明显下降，同时随着转染时间的延长，其细胞增殖率进一步下降。

5.细胞凋亡率检测（图3）

图3 siRNA-Mcl-1转染后13例阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者CD59-细胞各组不同时间点的凋亡率情况

流式检测各组细胞的凋亡率情况，siRNA-Mcl-1转染组细胞凋亡率高于siRNA-scr 转染组和空白对照组［（43.12±16.33）%比（24.07±15.42）%、（21.56±14.85）%］，差异均有统计学意义（均P<0.05），提示Mcl-1基因可能有抗凋亡作用。

6.细胞周期分布情况

流式检测细胞周期分布情况，siRNA-Mcl-1转染组G0∕G1期细胞比例高于siRNA-scr转染组和空白对照组［（93.16±3.06）%比（91.52±4.01）%、（90.78±3.62）%］，而S 期细胞比例低于siRNA-scr 转染组和空白对照组［（4.96±3.21）%比（6.86±3.87）%、（7.05±3.59）%］，差异均有统计学意义（均P<0.05）。这提示减低Mcl-1 基因后，G0∕G1期细胞比例增加，S 期细胞比例减低，表明了细胞周期向G0∕G1期移动，细胞的增殖能力下降。

讨论

目前，关于PNH克隆如何获得增殖优势尚未形成共识，我们既往的研究提示，调节性T 细胞的免疫抑制作用在PNH 患者中增强，可能在PNH 异常克隆中起了逃避免疫监视的作用［5］。Horikawa 等［6］和Brodsky［7］分别报道了PNH 患者的异常血细胞有抵抗凋亡的能力，现多项研究已表明单独的PIG-A 基因突变并不能引起异常克隆对凋亡的抵抗，PNH 克隆在体内获得生存及增殖优势可能与其他因素有关［8-12］。凋亡机制在PNH 克隆增殖中的作用是PNH 发病机制研究的热点。有研究指出，凋亡的减少是由于GPI 阴性细胞持续存在及占据优势所致，如果突变的PNH 细胞能够抵抗凋亡，那么易使其获得克隆优势［13-15］。Heeney 等［3］发现一些抗凋亡基因（Mcl-1、human A1、Hhr23B、RhoA）在PNH 患者有明显的高表达，且其外周血中性粒细胞和单核细胞中又发现了抗凋亡基因过度表达。抗凋亡基因上调可能导致PNH 和相关疾病凋亡抵抗，这也提示了凋亡机制参与PNH克隆的增殖。

Mcl-1 基因作为Bcl-2 家族的一个抗凋亡成员，是在研究人ML-1 髓白血病细胞系用佛波酯诱导后，沿单核∕巨噬细胞途径分化过程中，作为早期诱导基因被首次发现的，其表达与调节异常与许多疾病有关［16-18］。相关研究显示，通过反义寡核苷酸技术或小分子干扰RNA 抑制Mcl-1基因的表达，可引起表达Mcl-1 的肿瘤细胞的凋亡［19-21］。另外，阻断调节Mcl-1 基因表达的信号途径也能有效地诱导细胞凋亡［22-23］，表明Mcl-1 的过表达可以促进恶性肿瘤细胞生存。Heeney 等［3］发现Mcl-1 在PNH 患者有显著的高表达，但目前，没有关于应用siRNA 抑制PNH 患者Mcl-1 表达的研究。本研究探讨Mcl-1 基因表达是否降低PNH 克隆的凋亡率，发现同一PNH 患者CD59-细胞的Mcl-1 mRNA 的表达量明显高于CD59+细胞和对照组，且Mcl-1 mRNA 的表达量与CD59-细胞克隆数呈正相关，表明Mcl-1基因在PNH 的克隆扩增中可能起促进作用。本研究中利用siRNA 干扰技术减低Mcl-1 基因的表达后，PNH 患者CD59-细胞的增殖率下降，凋亡率增加，同时，细胞周期分布提示其向G0∕G1期推进，细胞增殖力下降，进一步表明了Mcl-1 基因促进CD59-细胞的增殖，与既往研究发现抗凋亡基因在PNH 患者体内存在高表达是一致的。

研究表明，PNH 克隆逃逸凋亡可能致增殖优势，Mcl-1 基因的过表达可能在PNH 克隆抗凋亡中起作用，但本研究例数偏少，研究结论还需要加大病例数进一步验证结果。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突