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PHH3改良计数方法在核分裂计数中的应用价值

2023-07-17张占蛟徐中海章珊张雪莲南京金域医学检验所江苏南京210000

首都食品与医药 2023年14期
关键词:核分裂危险度阳性细胞

张占蛟,徐中海,章珊,张雪莲 (南京金域医学检验所,江苏 南京 210000)

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)经常与其他恶性肿瘤同时发生,大多数病例为腺癌[1]。由于GIST和脂肪肉瘤都是间质性起源,所以它们的共存非常罕见。GIST的诊断大多依据影像学检查如计算机断层扫描和MRI、内窥镜和组织活检[2],然而,影像学检查结果大多不具备特异性,而最终确诊往往需要组织标本病理学检查。

磷酸化组蛋白H3(Phospho-histone H3,PHH3)是细胞质核心染色质的重要组成之一,其在有丝分裂的早期、中期、后期与末期的核分裂象均呈阳性表达,而在分裂间期及核固缩、核碎裂均不表达。它是研究细胞核有丝分裂特异性较高的抗体之一,近年来被用于研究和肿瘤核分裂相关的一些项目。然而,笔者在实际工作中发现,PHH3的阳性细胞计数要远高于HE染色下核分裂计数。分析原因,考虑是PHH3染色存在某些未知的细胞非特异着色,从而造成计数远高于实际核分裂数,而人工在HE下计数核分裂,仅计数形态明确的核分裂[3],由此造成了计数差异,那么,PHH3这个抗体对于病理医生到底还有没有帮助呢?本文选取胃肠道间质瘤作为实验对象,进一步明确这一抗体在实验中的作用。

本文收集了南京金域医学检验所2019年1月-2021年12月期间进行病理检查的胃肠道间质瘤患者52例为研究对象,同时在HE下和PHH3标记下进行核分裂计数,并进行比较。以明确PHH3对于临床病理医生核分裂计数是否有所帮助,以此增加准确度、减轻工作量、缩短工作时间。与以往计算PHH3阳性细胞数不同的是,本次研究仅计数PHH3阳性细胞内可明确辨认为核分裂的细胞。以此过滤掉一些非特异着色,增加准确度。此研究为回顾性分析,不涉及患者姓名、年龄等隐私信息,现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集南京金域医学检验所2019年1月-2021年12月期间进行病理学检查的胃肠道间质瘤患者52例为研究对象,其中低度危险性42例,中度危险性8例,高度危险性2例,采用随机的方法进行排列。同一肿瘤组织分别进行HE染色和PHH3免疫组化标记,计算两种不同染色方法下核分裂数和观测时间并进行比较。

1.2 方法 标本均经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片厚度4微米。裱贴于防脱片玻片上,PHH3抗体及二抗、DAB显色剂均采用迈新生物试剂。免疫组化方法采用En Vision两步法,高压锅抗原修复。免疫组化操作人员为资深病理技术员,有多年的免疫组化制片经验[4]。所有病例在核分裂计数时均用了PHH3进行标记,并且每例标本均经过3位资深病理医生于高倍镜下分别计数5mm2视野的核分裂数,计算其平均值。同时分别记录HE和PHH3的阅片时间,并计算平均阅片时间[5]。所有数据经jamovi软件分析,计算PHH3和HE下核分裂的数量及平均时间,并对二者进行比较,分析其相关性。

1.3 结果判读 由于目前GIST的核分裂计数标准为HE下人工计数,通常仅能辨认明确的有丝核分裂(见图1),故计数PHH3标记的核分裂数时仅计算形态明确的有丝核分裂(见图2),而不是计数所有阳性细胞(见图3),因为那样将导致GIST危险度升级,可能给患者带来过度治疗,影响身体健康,同时给患者增加不必要的经济支出。

图1 HE下核分裂

图2 PHH3下核分裂

图3 PHH3下非特异阳性细胞

1.4 统计分析 所有数据经jamovi软件分析,计数5mm2视野的核分裂数,计算其平均值,同时分别记录HE和PHH3的阅片时间,并计算平均阅片时间。计算PHH3和HE下核分裂的数量及平均时间,并对二者进行比较,分析其相关性。计量资料采用±s表示,组间比较采用t检验,计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验,双侧P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHH3和HE下核分裂数的相关性分析 假设HE下核分裂≠PHH3下核分裂,PHH3下核分裂计数和HE总体一致(P>0.05),没有统计学差异性,PHH3可以用于核分裂计数。

2.2 PHH3和HE计数核分裂所用时间的比较分析,PHH3下核分裂计数所用时间相比HE下所用时间减少了131%。

2.3 经过PHH3染色计数核分裂后重新评估危险度,与HE下危险度前后一致。

3 讨论

胃肠道间质瘤(GIST)是独立起源于胃肠道间质干细胞的肿瘤,属于消化道间叶性肿瘤,发病率10/100万-20/100万,年龄多在40岁以上,中位年龄为50-60岁,男女发病率相当,但有些报道提示男性发病率略高,儿童少见[6]。GIST的确诊最终需病理切片及免疫组化的结果。其治疗方式主要为手术治疗及靶向药物治疗(口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂——格列卫),其预后取决于肿瘤的危险度、大小、生长位置、有无转移等。而GIST危险度的判断,目前标准为计数5mm2核分裂数,再结合肿瘤的大小、有无自发破裂、坏死等来综合判定[7]。在更好的计数方法出现以前,人工在显微镜下数核分裂是主要的方法,其不仅用时较长,且容易视觉疲劳,容易漏数。

PHH3改良计数方法的简便性及省时性不仅可以用于GIST的诊断,还可以用于所有需要观测肿瘤核分裂的场景中,如神经内分泌肿瘤、乳腺浸润性导管癌等涉及到病理分级分期的诊断中,在一些软组织肿瘤的诊断中,核分裂的多少甚至关系到良恶性或恶性程度的诊断,其虽然不如其他免疫组化抗体在诊断中起着一些关键性的作用,但仍然给病理医生的诊断工作带来了很大的便利性和直观性[8]。

磷酸化组蛋白H3(Phospho-histone H3,PHH3)是新近发现的五个核心组蛋白之一,在真核细胞中与其他组蛋白构成染色质中的主要蛋白组分[9]。PHH3在有丝分裂的G2期及M期达到最大值,因此被认为是一种特异性的核分裂标志物。磷PHH3抗体被认为是细胞增殖的生物标志物,对有丝分裂中的细胞具有特异性,在不同恶性肿瘤中具有预后价值,但在胃肠道间质瘤(GIST)中的研究很少[10]。本研究主要对同一肿瘤组织分别进行HE染色和PHH3免疫组化标记,计算两种不同染色方法下核分裂数和观测时间并进行比较,以评估PHH3改良计数方法在核分裂计数中的作用。应用PHH3的改良计数方法得到的核分裂数和HE下核分裂数基本一致,没有统计学差异,同时可以节约大量时间。因此笔者认为,PHH3这一抗体应用于临床病理工作可以为病理医生节约大量时间,并减少漏数几率,提高核分裂计数精确度,但要注意精确识别核分裂才可纳入计数范围。

目前PHH3已经被证实对确定肿瘤细胞的核分裂象,区分核分裂象和凋亡小体、核碎片非常有用[11-12]。目前PHH3下计数核分裂时仅观察明确的有丝分裂,而不是计算所有的阳性细胞,这给计算机阅片计数带来技术上的困难,对于计算所有阳性细胞的诊断标准仍然需要更多的样本量及更多的研究来确定[13-14]。PHH3改良计数方法在临床病理诊断工作中用于核分裂计数,其不仅计数准确、不易漏数,且用时远远短于常规HE下计数方法,给临床病理医生节省了很大的时间成本,可以在病理实验室推广应用。

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