吴彦辉 蒲团卫 张生杰 牛龙龙 白静科 李成军 李建华

摘要 ［目的］防止隐症携带烟草花叶病毒（TMV）的烟苗移栽到大田造成产量损失。［方法］根据TMV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因保守序列设计引物及探针，通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析，建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。［结果］该方法特异性好，与其他常见的烟草病毒无交叉反应；灵敏度高，检测下限可达到4.53×101 copies/μL，比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍；建立的标准曲线斜率为-3.299，决定系数（R2）为0.993 3，扩增效率为100.97%，且循环阈值（Ct）与质粒标准品浓度之间线性关系良好，重复性试验结果可靠。［结论］利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品，检测结果一致，进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。

关键词 烟草花叶病毒；实时荧光定量PCR；TaqMan探针法

中图分类号 S 435.72  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）12-0171-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.039

Establishment of Real-time PCR Detection Method of Tobacco Mosaic Virus

WU Yan-hui， PU Tuan-wei， ZHANG Sheng-jie et al

（Xuchang Branch of Henan Provincial Tobacco Company， Xuchang， Henan 461000）

Abstract ［Objective］To prevent the yield loss caused by tobacco seedlings with cryptic disease which carrying tobacco mosaic virus （TMV） transplanting to fields.［Method］ A TaqMan-qPCR method for detection TMV was established in the study. Firstly， primers and probe were designed based on the conused sequence of TMV coat protein gene， then a standard curve was prepared using a recombinant plasmid containing the target gene fragment. ［Result］ This method had good specificity and no cross reactivity with other common tobacco viruses.The detection limit was 4.53×101 copies/μL which displaying a higher sensitivity than the conventional RT-PCR with 10 times. The slope of standard curve was -3.299， and the correlation coefficient was 0.993 3 with the efficiency 100.97%. The linear relationship between the cycling threshold （Ct） and the concentration of plasmid standard was good， and the repeatability test results were reliable.［Conclusion］TaqMan-qPCR method and conventional RT-PCR method were used to detect tobacco seedlings samples respectively， and both of the results were consistent which revealed the reliability of TaqMan-qPCR method.

Key words Tobacco mosaic virus;Real-time qPCR;TaqMan probe

基金項目 许昌市烟草公司科技项目（2021411000240104）。

作者简介 吴彦辉（1989—），男，河南新乡人，农艺师，硕士，从事烟草农业技术研究与推广工作。

*通信作者，高级农艺师，从事烟草农业技术研究与推广工作。

收稿日期 2022-08-15

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的代表种，作为一种模式材料，在植物病毒的基础研究和应用研究上都占有重要的地位［1］。烟草是我国的重要经济作物，TMV是烟草生产中的一类主要病害，长期危害烟叶的产量、质量和种植效益。TMV主要通过机械摩擦传播［2］，随着烟草生产上集约化漂浮育苗的大力推广，育苗过程中的苗龄和剪叶次数增加，烟苗TMV的阳性检出率也提高［3］，漂浮苗带毒已成为大田烟草花叶病毒病的一个主要初侵染源［4］。监测漂浮育苗过程中的烟苗带毒情况，从源头防止TMV的传播与流行，对烟草病毒病的有效防控具有重要意义。

长期以来，学者们致力于烟草病毒检测技术的研究与应用，目前较常用的主要有酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术和高通量测序技术等。其中，酶联免疫吸附法被应用于多个地方烟草病毒病的检测［5-11］；PCR技术衍生出多种单重和多重检测方法［12-16］，被应用于陕西［15］、广西［16］、云南［17］、毕节［18］ 、河南［19］等地烟草病毒病的种类、分布及侵染情况分析；高通量测序技术因其易于发现新病毒的优点也逐渐被应用于烟草病毒的种类检测［20-23］。然而，ELISA方法的特异性和灵敏性还有待提高，PCR技术过程烦琐，难以检测出低丰度病毒样品，高通量测序技术也存在成本高、不适用于生产上快速检测等缺点。

近年来，实时荧光定量PCR技术凭借其特异性强、灵敏度高、可对样品实时快速定量检测等优点成为一种重要手段，应用于多种植物病毒的有效检测［24-32］，赵立群等［32］建立的基于TaqMan探针法实时荧光定量PCR方法能够检测到最低拷贝数为2×103 copies/μL的病毒，灵敏度是RT-PCR的100倍，特异性强，灵敏性高。鉴于此，该研究拟建立一种高灵敏性、强特异性的TaqMan-qPCR检测方法，以适用于苗期TMV隐症携毒等低丰度样品的检测，为无毒烟苗培育提供快速、有效的监测手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。

供试材料TMV、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）、煙草脉带花叶病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）及番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）由河南省农业科学院烟草研究所植物保护课题组惠赠。

1.1.2 仪器。

Agilent Technologies Strategene MX3000P实时荧光定量 PCR 仪（美国ABI公司，ABI7500）；Eppendorf D30紫外分光光度计；美国伯乐BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像分析系统；美国伯乐BIO-RAD T100 PCR仪；卢湘仪TGL-16M型高速冷冻离心机。

1.1.3 试剂。

Trizol（Invirtogen）；反转录试剂盒 PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect real-time，TaKaRa公司）；Premix Taq酶（TaKaRa Taq Version 2.0，TaKaRa公司）；胶回收试剂盒（TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit，TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技有限公司）；pMDTM 18-T Vector（TaKaRa公司）；感受态细胞（Trans 5α，北京全式金生物技术有限公司）；引物和探针合成及DNA测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成。

根据NCBI数据库中TMV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因保守序列（AJ239099.1），参照引物和TaqMan探针设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性。上游引物TMV-F：GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT；下游引物TMV-R：GTTCGCCTGATTTT-CAACTTCT；探针：FAM-TACAGGTACAATGCGGT-MGB；产物长度为126 bp，引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 烟草总RNA的提取。取0.1 g TMV病毒样本，参照Trizol试剂说明书提取总RNA，利用分光光度计测定所提RNA的浓度，结合1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，选取OD260/OD280在1.8～2.1的RNA样本进行后续试验。

1.2.3 RT-PCR反应及条件。cDNA第一链的合成反应参照反转录试剂盒说明书进行，所得cDNA置于-20 ℃保存用于后续试验。PCR反应体系：Premix Taq酶 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；最后在72 ℃延伸10 min。

1.2.4 目的基因克隆与鉴定。上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后连接至pMD18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37 ℃过夜培养后经蓝白斑筛选，挑选白色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养（37 ℃，220 r/min，15 h）。菌液经质粒提取PCR检测后，把符合预期大小的质粒样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.5 质粒标准品的制备。质粒样品经测序序列正确后，用分光光度计测定质粒OD260的值，运用公式（1）计算出质粒浓度拷贝数，将其作为TMV质粒标准品使用。

C=A/B×6.02×1014（1）

式中，A代表质粒浓度（ng/μL），B代表质粒DNA分子量，C代表质粒浓度拷贝数（copies/μL）。

1.2.6 标准曲线的建立。将质粒标准品用EASY Dilution按照10倍梯度稀释，获得终浓度为4.53×101～4.53×109 copies/μL的9个质粒样品，以稀释后的质粒样品作为模板，在实时荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR，每个浓度进行3次重复，仪器自动生成标准曲线。反应体系为20 μL：Probe qPCR Mix（2×）10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，探针 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μL，质粒模板2 μL，ddH2O 6.2 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃变性5 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，45个循环。

1.2.7 特异性检测。分别提取TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV、TSWV的RNA后经反转录试剂盒合成第一链cDNA，以合成的cDNA为模板，利用TMV-F/TMV-R引物进行常规PCR扩增，健康烟草的cDNA为阴性对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物切下相应条带参照胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，测定序列在GenBank数据库中进行Blast比较分析。

1.2.8 灵敏度检测。分别以终浓度是4.53×101～4.53×109 copies/μL的9个质粒标准品进行RT-qPCR和常规PCR，比较2种方法的检测灵敏度。

1.2.9 检测体系的应用。随机采集16份烟苗样品经总RNA提取，RT-qPCR病毒检测后，根据扩增曲线和 Ct 值确定其带毒情况，并根据标准曲线计算出病毒感染样品的携毒量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以10倍梯度稀释的9个质粒样品作为模板进行RT-qPCR扩增后，绘制标准曲线，标准曲线斜率为-3.299，决定系数（R2）为0.993 3，扩增效率为100.97%，且在质粒标准品浓度4.53×101～4.53×109 copies/μL，循环阈值（Ct）与质粒标准品浓度之间线性关系良好（图1）。因此，可根据待检测样品的Ct值参照此标准曲线进行样品含毒量的检测。

2.2 荧光定量PCR的重复性试验

分别以10倍梯度稀释的9个质粒标准品为模板进行扩增，每份标准品设置3次重复，通过计算Ct值的标准偏差与变异系数对试验重复性进行评价，结果见表1。表1显示，标准偏差较小，变异系数均小于1%，表明该试验重复性良好，试验结果可靠。

2.3 引物的特异性验证

TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV、TSWV利用TMV-F/TMV-R引物进行常规PCR扩增后，凝胶电泳结果表明，TMV样品能扩增出约126 bp的条带，而其他病毒和阴性对照均未扩增出此条带（图2）。目的条带回收测序结果显示经TMV-F/TMV-R扩增所得序列为TMV的CP基因片段。

2.4 荧光定量PCR的灵敏度试验

TaqMan探针法荧光定量PCR灵敏度试验结果表明，该方法能够最低检测出4.53×101 copies/μL的病毒样品（图3），而常规RT-PCR检测方法能够最低检测出4.53×102 copies/μL的病毒样品（图4），显然TaqMan探针法荧光定量PCR检测TMV的灵敏度比常规RT-PCR检测提高了10倍。

2.5 荧光定量PCR的应用

利用建立的TaqMan-qPCR检测采集的烟苗样品携带TMV情况，结果发现（图5），样品1～13扩增曲线较好，样品14～16未出现扩增峰型，说明16份样品中有13份携带有TMV。常规RT-PCR结果（图6）显示，样品1～13有特异的单一条带出现，而样品14～16未扩增出明显条带，且样品5和样品11～13目的条带较浅，对应荧光定量Ct值较大（表2）。综上所述，常规RT-PCR进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。

3 讨论

病毒病被称为植物的“癌症”，尚未找到有效的防治措施，主要通过无毒苗培育、消除传播媒介等手段进行预防。目前烟草生产上广泛应用的漂浮育苗技术有利于实现育苗技术的规范化和成苗质量的标准化，在降低土传病害感染风险、增强烟苗抗逆能力、调节温湿度、控制水肥等方面具有明显优势，能够最大程度促进烟草生产效率，但其由于集约化程度高、操作频繁等因素，易造成病害的发生与流行［33］。在漂浮育苗过程中，发生的病毒病以TMV为主［34］，其中剪叶操作是引起TMV传播的主要途径［35］，而带毒烟苗是大田发病的重要病原［36］。大量烟草田间病毒病检测结果表明，TMV在全国大部分烟区均为主要病毒［5-11］。该研究中采集的无

明显病毒症状的烟苗样品也能检测出少量病毒，因此，该研究建立的检测方法可为防止隐症携毒烟苗移栽到大田提供有效监管措施。

多项研究证实实时荧光定量 PCR技术较常规RT-PCR技术在检测灵敏度方面具有明显优势，丁天波等［24］建立的番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）RT-qPCR方法能够检测出的ToCV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL，比常规RT-PCR法灵敏100倍；贺振等［25］建立的甘薯潜隐病毒莲藕分离物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）实时荧光定量PCR能够检测到7×101 copies/μL 的阳性质粒，灵敏度为普通PCR的100倍；王艳娇等［26］建立的柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus，CVEV）实时荧光定量 PCR 能够检测到7×101 copies/μL的质粒，灵敏度比常规RT-PCR高100倍；胡加谊等［27］建立的菠萝凋萎相关病毒-3（pineapple mealybug wilt associated virus-3，PMWa V-3）實时荧光定量PCR的最低检出限为313 copies/μL，灵敏度是普通RT-PCR的10倍；林铭等［28］建立的番茄黄化曲叶病毒病（tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD）实时荧光定量PCR能检测到106倍的稀释液，比普通PCR法的灵敏度提高了100倍；李玉琦等［37］建立的马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）RT-qPCR灵敏度为13 fg/μL，灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。该研究建立的TMV的TaqMan-qPCR检测下限为4.53×101 copies/μL，灵敏度为常规RT-PCR检测技术的10倍，同样证实荧光定量PCR技术较常规RT-PCR技术更灵敏，但较其他研究灵敏度尚需提高。

4 结论

该研究建立的烟草普通花叶病毒荧光定量PCR检测方法无需凝胶电泳和染色，节省了病毒检测时间，且重复性好、灵敏度高，其检测下限为4.53×101 copies/μL，比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍，更适用于隐症携毒烟苗样品的检测，可为无毒烟苗移栽提供技术支撑。

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