贾斌鑫,杨世英,王 艳,杨朋朋,何伟忠,王 成,刘峰娟,范盈盈

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(乌鲁木齐)/新疆农产品质量安全重点实验室,乌鲁木齐 830091;3.伊犁师范大学生物与地理科学学院,新疆伊宁 835000)

0 引 言

【研究意义】随优质的甜瓜种类逐渐丰富,更多注重甜瓜核心品质的探索[1],糖分含量是评价葫芦科作物果实品质一项重要指标[2],甜瓜中的糖分主要是果糖、葡萄糖、蔗糖,其中果糖的甜度最高,葡萄糖的口感最好。甜瓜的甜度、风味由这3种糖决定,并且甜瓜中的维生素、芳香物质和色素等的基础原料也都来源于该3种糖[3]。在甜瓜中的含量和所占比例有一定的差异,糖分积累是一个复杂的过程。【前人研究进展】研究表明[4],在果实的糖分积累过程中最终以蔗糖的形式积累,参与该过程的关键酶为蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)、转化酶(invertase,Ivr)和蔗糖合成酶(sucrose synthase,SS[5]),其中转化酶包括酸性转化酶(acid invertase,AI)和中性转化酶(neutral invertase,NI),蔗糖合成酶分为分解方向(SS-c)和合成方向(SS-s),以分解为主。SPS是蔗糖积累的关键限速酶[6],在果实发育期,SPS的活性随着甜瓜的成熟而逐渐升高,SS-s活性则随着甜瓜的成熟而减低,SS-c与蔗糖积累相关性并不显著,而2个转化酶在甜瓜发育前期活性很高,在成熟甜瓜中的活性极低[7-9]。【本研究切入点】糖组分含量是决定甜瓜的风味品质的重要因素之一。甜瓜中的可溶性糖主要是果糖,葡萄糖和蔗糖,果糖是甜瓜甜度的直观表示。目前有关新疆甜瓜可溶性糖与糖代谢酶的相关性分析的研究鲜有报道。需研究不同品种甜瓜糖组分及其相关代谢酶活性差异。【拟解决的关键问题】选用新疆地方特色的9种不同风味的厚皮甜瓜甘甜蜜宝、西州蜜1号、早醉仙、纳斯密、黄梦脆、白皮脆、西州蜜25号、俊秀和20-123,测定糖组分和糖代谢相关酶,比较9种甜瓜糖分的含量以及相关代谢酶的活性差异,分析糖组分与酶活性相关性,分析不同甜瓜糖组分含量以及糖代谢酶活性的差异,为新疆不同品种甜瓜育种和甜瓜产业推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 甜 瓜

选择9种不同品种甜瓜:甘甜蜜宝、西州蜜1号、早醉仙、纳斯密、黄梦脆、白皮脆、西州蜜25号、俊秀和20-123均采自新疆吐鲁番,甜瓜为大棚种植,统一管理,成熟后,随机挑选成熟度适中,无病虫害的各品种甜瓜,并于24 h内运回实验室,运回后,立即取样、液氮冷冻后,-80℃冰箱保存。

1.1.2 试剂与仪器

牛血清蛋白质、曲拉通X-100(TritonX-100)、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、间苯二酚、乙二醇、还原型辅酶Ι二钠(NADH-Na2)、脲苷二磷酸(UDP)、果糖、吗啉乙磺酸(MES)、6-磷酸果糖、脲苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glucose)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)等试剂(北京索莱宝科技有限公司);3,5-二硝基水杨酸(DNS)(上海源叶生物科技有限公司);盐酸、氯化镁、氟化钠(西安化学试剂厂);乙腈(赛默飞世尔科技中国有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA)(天津市福晨化学试剂厂);十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)(西陇化工股份有限公司);磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)(天津市致远化学试剂有限公司)。

1.1.3 仪 器

紫外可见分光光度计 UV-2700(日本岛津公司);电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);Biofugerstratos全能型高性能台式冷冻离心机(德国贺利氏公司);高效液相色谱仪(美国沃特斯);折光仪(上海光学仪器)。

1.2 方 法

1.2.1 可溶性固形物测定

采用折光仪测定可溶性固形物,先取蒸馏水滴在玻璃面上进行调零校正,随后擦拭干净后,在瓜不同位置进行取2滴果肉汁,每种瓜平行测量3个,每个瓜读取5个值。

1.2.2 不同甜瓜糖组分提取与测定

甜瓜中糖组分提取与测定参考国家标准《GB 5009.8-2016 食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》,取混合瓜样10 g于刻度离心管中,用蒸馏水定容到30 mL,匀浆后,45℃水浴1 h,过0.22 μm滤膜后得到的滤液用来测定糖组分的滤液。

高效液相色谱条件为流动相为乙腈∶纯水=78∶22,色谱柱为Nucleodur100-5 NH2-RP(250 mm×4.6 mm),流速为1 mL/min,进样量为2 μL。

1.2.3 糖代谢酶提取与测定

蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)的提取测定方法参考任雷[10]、高俊凤[11];酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)的提取和测定方法参考赵智中等[12]。

SPS和SS提取:称取5 g甜瓜果肉,置于预冷的研钵中,分批加入5 mL提取缓冲液冰浴研磨提取,2℃下10 000 g离心20 min,取上清液3 mL装入透析袋,置于透析缓冲液中4℃透析过夜,其间更换透析液3次,透析后酶液定容至5 mL用于酶活性分析。

AI和NI的提取:称取5 g甜瓜果肉,置于含液氮的研钵中研磨3～5 min,加5 mL转化酶提取缓冲液再匀浆3～5 min,14 000 r/min离心15 min。取上清液,逐渐加(NH4)2SO4至80%饱合度。在4℃冰箱内放置30 min后,14 000 r/min离心30 min,去除上清液,加4 mL脱盐缓冲液溶解沉淀。沉淀溶解后,放入透析袋,置于稀释10倍的脱盐缓冲液中透析24 h(中间多次换透析液),透析后得的酶液用于酶活性分析。表1

表1 糖代谢相关酶提取体系

SPS活性测定:向0.4 mL的Tris-MES反应体系中加入0.1 mL UDPG和0.05 mL透析后酶液,补蒸馏水至1 mL,之后放到水浴锅中,保持30 ℃水温,反应10 min后,沸水浴4 min中止反应,对照将UDPG换做蒸馏水替代,其他试剂一样。加入0.1 mL 2 mol/L NaOH溶液,沸水浴10 min后冷却至室温。加3.5 mL 30%的HCl和1 mL 0.1%的间苯二酚溶液,震荡摇匀后放入80℃的水浴锅中保温10 min,冷却后在480 nm处比色测定蔗糖生成量。每个样品重复3次。用灭火的酶液作对照。酶活性单位为μmol/(h·g)。

SS合成方向测定同SPS,只将磷酸-6-果糖换成果糖。

SS分解方向:测定体系加入溶液,30℃反应1 h,加入49.0 μL DNS试剂终止反应,沸水浴5 min,冷却后测定A540值。每个样品重复3次。用灭活的酶液作对照。酶活性单位为μmol/(h·g)。

转化酶AI和NI活性测定:总反应体系为1.6 mL,37℃温水浴1 h,加入1.1 mL DNS试剂终止反应,沸水浴15 min,冷却后用分光光度计测定A540值。每个样品重复3次。用杀死的酶液作对照。酶活性单位为μmol/(h·g)。

中性转化酶的活性测定与酸性转化酶类似,只是缓冲液换为磷酸缓冲液(pH 7.5)。表2

表2 糖代谢相关酶测定体系

1.3 数据处理

采用 Excel2019 统计数据,指标的均值间比较均用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,P<0.05为显著差异,P<0.01为极显著差异。所有的指标测定均有3次重复,结果用测定指标的平均值±标准误差表示,使用Oringin软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 甜瓜中的可溶性固形物含量变化

研究表明,可溶性固形物在9种甜瓜中差异显著(P<0.05),其中纳斯密的可溶固形物含量最大,为16.8%,其次为早醉仙、20-123,其可溶性固形物为16.1%和15%,其余甜瓜的可溶固形物均低于15%,白皮脆和甘甜蜜宝的含量最少,分别为11.2%和12.2%。图1

图1 不同甜瓜品种可溶性固形物含量变化

2.2 甜瓜中糖组分含量变化

研究表明,在9种甜瓜中,果糖、葡萄糖和蔗糖含量差异显著,果糖含量最高的黄梦脆与含量最低的西州蜜1号差值为1.1 g/100g,葡萄糖在9种甜瓜中含量与果糖含量相比明显较低,普遍在0.9～2.2 g/100g,其中葡萄糖含量最高的为俊秀,含量为2.2 g/100g,含量最低的是西州蜜1号,含量为0.92 g/100g。在9种甜瓜中蔗糖含量差异较大,早醉仙的蔗糖含量最高为5.74 g/100g,最低的甘甜蜜宝含量仅为0.76 g/100g,二者相差近8倍。早醉仙的可溶性糖含量最高,西州蜜25号次之,甘甜蜜宝的含量最少,蔗糖在其中的贡献最大。图2,表3

图2 不同甜瓜品种可溶性糖含量变化

表3 不同甜瓜品种中可溶性糖差异

2.3 甜瓜糖代谢相关酶活性

2.3.1 甜瓜蔗糖磷酸合酶(SPS)活性差异

研究表明,甘甜蜜宝和西州蜜1号的SPS活性与其他的7种甜瓜差异显著(P<0.05),其中甘甜蜜宝SPS的活性最高,蔗糖活性为8.7 μmol/(h·g),黄梦脆的蔗糖活性最低为4.7 μmol/(h·g)。甘甜蜜宝的蔗糖含量为9种甜瓜中最少的,对于甘甜蜜宝SPS活性与蔗糖含量具有一定的相关性,但是对于其他不同品种甜瓜,SPS的作用存在着差异。图3

图3 不同甜瓜品种蔗糖磷酸合酶(SPS)活性变化

2.3.2 甜瓜转化酶(Ivr)的活性差异

研究表明,不同甜瓜中AI和NI酶的活性差异显著(P<0.05),其中20-123在AI和NI的活性分别为40.1和13.1 μmol/(h·g),为9种甜瓜中最高,而白皮脆的AI和NI活性最低,分别为0.3和0.2 μmol/(h·g),两者的AI相差了近133倍,NI相差了近65倍。图4

图4 不同甜瓜品种转化酶(Ivr)活性

2.3.3 甜瓜蔗糖合酶(SS)活性差异

研究表明,9种甜瓜中SS(合成)活性最高的是甘甜蜜宝,活性为7.5 μmol/(h·g),其次为白皮脆和黄梦脆,其活性分别为6.7和6.5 μmol/(h·g),活性最低的是20-123,为5.1 μmol/(h·g);SS(分解)方向酶活性最高的西州蜜25号,活性为3.9 μmol/(h·g),其次为20-123和纳斯蜜,含量分别为2.6和2.3 μmol/(h·g),含量最低的为早醉仙,活性为0.7 μmol/(h·g),9种甜瓜的SS活性差异显著(P<0.05)。图5

图5 不同甜瓜品种中蔗糖合酶(SS)活性

2.4 不同甜瓜品种蔗糖与糖代谢酶相关性

研究表明,9种甜瓜的蔗糖含量与糖代谢相关酶活有着一定的相关性,甘甜蜜宝的的蔗糖含量与NI、SPS和SS合成方向的酶活性呈正相关,与NI呈显著正相关(P<0.01),与AI和SS分解方向呈负相关,但并不显著;西州蜜1号的蔗糖含量与NI、SPS和SS合成方向呈正相关,与AI和SS分解方向呈负相关,都不显著;早醉仙和纳斯密的蔗糖含量只与AI的活性呈正相关,与NI、SPS、SS合成方向和分解方向的活性都为负相关;黄梦脆与AI、SPS、SS合成方向和分解方向的活性呈正相关,与NI呈负相关;白皮脆与AI、NI、SS合成方向和分解方向的活性呈正相关,与SPS的活性则呈负相关;西州蜜25号与NI、SS合成方向和分解方向的酶活呈正相关,其中与SS合成方向呈显著相关(P<0.05);俊秀与NI和SS合成方向的酶呈正相关,与SS合成方向呈显著正相关,与AI、SPS和SS分解方向呈负相关,与AI和SS分解方向呈显著负相关;20-123只与SS分解方向呈正相关,与其他蔗糖代谢酶均呈负相关,和SS合成方向呈显著负相关。表4

表4 蔗糖与糖代谢酶相关性

2.5 不同甜瓜果糖与糖代谢酶相关性

研究表明,甘甜蜜宝与5种糖代谢酶均呈正相关,与SPS显著正相关(P<0.05);西州蜜1号与AI、NI、SPS和SS分解反向呈正相关,与SS分解方向呈显著正相关(P<0.05),与SS合成方向酶呈负相关;早醉仙与SS分解方向呈正相关,与AI、NI、SPS和SS合成方向均呈负相关;纳斯密与AI、SPS、SS分解方向和SS合成方向酶活性呈正相关,其中与SPS呈显著正相关,与NI呈负相关;黄梦脆与2个转化酶均呈正相关,与SPS、SS分解方向和SS合成方向呈负相关关系,均不显著;白皮脆和西州蜜25号2个甜瓜与AI、NI、SS分解方向SS合成方向呈正相关关系,与SPS活性呈负相关;俊秀与NI、SPS和SS分解方向活性呈正相关,与AI和SS合成方向呈负相关;20-123只与SS分解方向活性呈正相关,与AI、NI、SPS和SS合成方向活性呈负相关关系,其中与SS合成方向呈显著负相关关系。表5

表5 果糖与糖代谢酶相关性

2.6 不同甜瓜葡萄糖与糖代谢相关酶相关性

研究表明,甘甜蜜宝和AI、SPS和SS分解方向呈正相关,与NI和SS合成方向呈负向相关;西州蜜1号与AI、NI、SPS和SS分解方向呈正相关,与SS合成方向呈显著负相关;早醉仙只与SS分解方向呈正相关,与其余四种酶活性均呈负相关;纳斯密与AI、SPS、SS分解方向和SS合成方向均呈正相关,只与NI呈负相关关系;黄梦脆只与NI呈显著正相关,与AI、SPS、SS分解方向和SS合成方向的酶活性呈负相关;白皮脆和西州密25号与两种转化酶、SPS和SS分解方向酶活性均呈正相关,只与SS合成方向呈负相关;俊秀与NI、SPS和SS呈正相关,与AI和SS合成呈负相关关系;20-123与AI、NI和SS合成方向呈正相关,其中与AI呈显著正相关,与SPS、SS分解呈负相关。表6

表6 葡萄糖与糖代谢酶相关性

3 讨 论

可溶性固形物是一种综合参数,主要包括糖、酸、纤维素、矿物质等成分[13]。邵旭鹏等[14]在对8种甜瓜的营养测定中,纳斯密中的可溶性固形物含量为18.2%与研究结果相差无异。在可溶性糖含量测定中,9种甜瓜的果糖、葡萄糖和蔗糖的含量差异显著,特别是蔗糖的含量,含量最高的早醉仙与含量最低的甘甜蜜宝相差了近8倍。

糖代谢相关酶中,SPS和SS-s的活性与甜瓜的蔗糖积累密切相关[7,8,15,16],SPS和SS-s的活性会随着甜瓜的成熟而升高,在甜瓜成熟时活性达到最高,呈正相关关系,是引起蔗糖积累水平的主要原因;研究的9种甜瓜中甘甜蜜宝SPS和SS-s的活性都很高,而在可溶性糖测定中,甘甜蜜宝的蔗糖含量并不高,可见SPS和SS-s在成熟的甘甜蜜宝中的作用并不显著。早醉仙的SPS的活性较低,而且在成熟的早醉仙中,其蔗糖含量只与AI呈正相关,其余均为负相关,但其蔗糖的含量是最高的,与之前的研究结果也有不同。SPS以尿苷二磷酸葡萄糖为供体[17,18],以 6-磷酸果糖为受体,催化合成6-磷酸蔗糖,6-磷酸蔗糖在蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphate phosphatase, SPP)的作用下脱磷酸并水解形成蔗糖和磷酸根离子,甘甜蜜宝蔗糖含量低而SPS活性高的原因可能有两种:(1)在甜瓜发育成熟过程中,供体和受体逐渐减少,高活性的SPS无法催化有限的供体和受体合成大量的6-磷酸蔗糖,以至于在成熟的甜瓜中蔗糖的积累达到了饱和,导致了蔗糖含量少但SPS活性高;(2)在甜瓜成熟过程中,催化6-磷酸蔗糖水解的SPP活性不断降低,只产生较少的蔗糖。刘凌霄等[19]表明,蔗糖积累能力不同的甜瓜(基因型不同)SPS的活性各不相同,不同积累型的甜瓜无论在春季还是秋季,在花后5～25 d内,SPS活性一直处在低水平,没有或几乎没有蔗糖积累,只有到了花后30 d,SPS的活性升高,甜瓜才有了蔗糖积累[20],而早醉仙在发育前期已经积累了大量的供体与受体,在花后30 d后,SPS活性逐渐升高,迅速催化合成了大量的6-磷酸蔗糖,在SPP的催化下蔗糖大量积累,造成了早醉仙蔗糖含量高,但SPS活性不突出的结果。Ivr和SS-c在甜瓜发育初期活性很高[21-23],会随着果实的发育而逐渐降低活性,在成熟的甜瓜果实中几乎检测不到其活性,而研究中西州蜜25号、俊秀和20-123转化酶的活性仍然处于较高的活性,其他甜瓜的转化酶的活性与其他研究文献[4,8,10,23]的结果接近。

4 结 论

不同品种的成熟甜瓜果糖、葡萄糖和蔗糖含量存在显著差异,特别是蔗糖的含量,黄梦脆的果糖含量最高,俊秀的葡萄糖含量最高,早醉仙的蔗糖含量最高;在糖代谢酶中,俊秀的AI和NI活性最高,甘甜蜜宝的SS-s活性最高,西州蜜25号的SS-c活性最高,甘甜蜜宝的蔗糖含量最低但SPS活性最高,早醉仙的蔗糖含量最高、但SPS的活性不突出。