王登峰,古努尔·吐尔逊,李建军,洪都孜·波拉提,杨学云,孟肖潇,吴建勇

(1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)/福建省动物药物工程实验室,福州 350002;2.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆动物疫病研究重点实验室,乌鲁木齐 830013)

0 引 言

【研究意义】山羊关节炎-脑炎(Caprine arthritis encephalitis,CAE)是一种山羊慢性传染病,发病羊临床表现为慢性多发性关节炎、滑膜炎、滑囊炎和幼畜脑炎,有时也发生间质性肺炎、间质性乳房炎和脑脊髓炎等临床症状,但大多数受感染山羊不表现出临床疾病[1]。【前人研究进展】目前尚未见到可一次检测各种基因型病原且敏感度较高的分子生物学检测方法[2,5-7]。CAEV感染后,感染动物至少针对4种病毒主要抗原产生抗体:外膜糖蛋白(SU,gp135)和跨膜糖蛋白(TM,gp45)、衣壳(CA,p28)和基质(MA,p16)蛋白,一旦感染后抗体持续存在[8]。迄今为止,CAE血清学诊断的主要方法是基于三种不同抗原组合之一的血清学免疫酶分析:全病毒抗原(SU、TM、CA和MA的混合物),或重组TM和CA抗原组合,或SU抗原,其中使用全病毒抗原检测被测动物血清中总抗体水平是检疫上较常用的方法[9]。【本研究切入点】由于山羊感染CAEV后终生带毒,刺激产生的抗体持续存在,虽存在多种基因型毒株但其抗原性高度交叉,检测病毒刺激产生的特异性抗体成为判断感染的主要方法[2,10],寻找和设计适配各种型和亚型的通用检测引物极为困难,需研究感染后抗体产生的时间和抗体的消长规律。【拟解决的关键问题】采用CAEV山东分离株和参考株(ATCC VR-905)经颈静脉感染关中奶山羊,收集的血清样本,运用CAEV/MVV总抗体检测试剂盒(IDEXX,J701)定期检测300 d内的动物血清抗体,分析感染后可检测抗体出现的时间和抗体水平的消长规律,为CAEV总抗体检测技术在检疫中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 CAEV毒株和试验动物

1987～1994年间新疆畜牧科学院兽医研究先后从甘肃、陕西、贵州、四川和山东分离到CAEV病毒,毒株的全基因组序列已提交至GenBank,登录号依次为KT749881、KT749879、KT749880、KT214469和KT749878。以gag-pol基因序列为基础进行遗传进化分析,确定所有分离株均属于B1基因型,其gag基因序列的相似性为99.2%～99.9%。奶山羊感染试验中使用山东株(KT749878)和购自美国菌种保藏中心的参考株(ATCC VR-905),其中山东株感染羊作为试验组,参考株感染羊作为参考株对照组。

从新疆石河子市某奶山羊养殖场购买关中奶山羊9只(<3月龄),其中公羊5只和母羊4只,所有羊购买前10 d经试管凝集试验(动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646—2002)确认为布鲁杆菌病血清学阴性。奶山羊购买后集中饲养,在感染前70 d和10 d分别采集血液样本,使用CAEV/MVV总抗体检测试剂盒进行抗体检测和血液DNA中CAEV前病毒p28蛋白基因(p1:5’- ATA GTA GTG CAA GCA GCA GGA-3’;p2:5’-TGC ATT TTG AAC CCT TCT GAT CCC-3’)检测,确认为CAEV感染阴性羊。

1.1.2 主要试剂

CAEV/MVV总抗体检测试剂盒(IDEXX CAEV/MVV Total Ab,J701)购自IDEXX公司(美国);PrimeScript RT reagent Kit、SYBR premix Ex Taq II购自宝日医生物技术(北京)有限公司;动物组织DNA提取试剂盒(DP318)、病毒RNA提取试剂盒(DP315-R)、2×TaqPCR MasterMix(KT201-02)、D2000 DNA Marker(MD114)购自天根生化科技(北京)有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

奶山羊随机分成3组,每组3只:试验组感染CAEV山东株、参考株对照组感染ATCC VR-905和阴性对照组。使用较高的感染剂量:试验组感染剂量为4.04×108copies/羊,参考株对照组为5.80×107copies/羊,阴性对照组静脉注射同步处理的正常细胞培养上清液2 mL。感染前第10 d时单只羊隔离同等条件饲养。感染后的第8、15、24、28、42、58、71、84、99、113、128、155、170、182、210、243、273、300 d用EDTA-K2抗凝管和血清采集管分别采集颈静脉血液样本3～5 mL,每种血样分成3份。

试验期间对山羊进行临床记录,结束后试验羊全部颈静脉放血宰杀,采集前肢关节滑膜组织进行CAEV前病毒p28基因的扩增、测序和比对分析,并进行病理剖检,随后焚烧销毁处理。

1.2.2 奶山羊感染后CAEV总抗体的检测

使用IDEXX公司(美国)生产的CAEV/MVV总抗体检测试剂盒进行血清中CAEV全病毒特异性抗体的检测。

其中,OD450sample为样本OD450nm值,OD450negative为阴性对照平均OD450nm值,OD450positive为阳性对照平均OD450nm值。结果判定标准为Value<30%为阴性,30%≤Value<40%为可疑,Value>40%为阳性。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 6.0绘制抗体动态曲线图;抗体水平的组间比较采用方差分析;采用Origin 2018软件绘制基于非线性曲线模型的抗体动态拟合曲线。

2 结果与分析

2.1 感染鉴定

研究表明,在300 d的监测周期内,未观察到试验组和参考株对照组山羊出现关节炎或关节肿大、脑炎等临床症状;试验羊剖检后也未见肺脏、脑组织、乳腺和关节等出现临床病理变化。监测期结束后,试验羊宰杀后取前肢关节滑膜组织进行CAEV前病毒p28基因扩增和序列测定,试验组和参考株对照组扩增的靶标序列分别与感染用山东株、参考株(ATCC VR-905)的相似度大于99.9%,试验羊和参考株对照羊感染的病毒与设计一致,阴性对照组中靶标序列检测为阴性。图1

注：A:奶山羊感染CAEV后抗体水平变化趋势;B:山东株试验组、参考株对照组和阴性对照组抗体水平的组间比较;1:山东株试验组;2:参考株对照组;3:阴性对照组;**** 表示P<0.001

2.2 感染后抗体监测

研究表明,感染后第24 d时,试验组1只公羊和参考株对照组1只母羊和抗体转阳;第28 d时,试验组无变化,参考株对照组再次有1只母羊抗体转阳;第42 d时试验组其余2只羊转阳;参考株对照组无变化;第71 d时,试验组均为阳性,参考株对照组第3只羊(公羊)抗体转阳。试验组和参考株对照组山羊抗体转阳后在各个检测时间点均为阳性,阴性对照组抗体始终为阴性。

试验组和参考株对照组山羊感染CAEV后,在抗体转阳后至感染后第99 d期间CAEV总抗体OD450值呈快速上升趋势。试验组在感染后第99 d时抗体OD450值达到顶峰,在余下的200 d监测期间内维持在较高值的平台期;参考株对照组抗体平均OD450值在感染后180 d时达到顶峰,虽自155 d起抗体平均OD450值均较高并维持至监测结束,但该期间个体值差异较大。阴性对照组的平均OD450值始终较低且判定为抗体阴性的状态。在整个监测周期内,试验组和参考株对照组的抗体水平均极显著高于阴性对照组(P<0.001),但两者之间无统计学差异(P>0.05)。图1

2.3 抗体水平动态曲线的非线性拟合

研究表明,奶山羊感染后抗体变化趋势整体呈现抛物线状,但各感染羊自抗体转阳后的整个监测期间其抗体值的95%置信带最低值和95%预测带最低值均高于阳性临界判定值,抗体转阳后的整个监测周期内均可使用检测总抗体的方法鉴别感染羊。

CAEV感染组抗体转阳后的整个监测期内,试验组3只羊的抗体OD450值95%预测带均在0.5～2.3,参考株对照组1只羊的抗体OD450值95%预测带在0.5～2.6,其它2只羊在0.5～1.5,我国分离的山东株和参考株(ATCC VR-905)在刺激山羊产生体液免疫方面可能存在差异。图2

注：山东株试验组:A:1号羊(公);B:2号羊(母);C:3号羊(公);参考株对照组:D:1号羊(母);E:2号羊(公);F:3号羊(公)

3 讨 论

1987～1994年间先后从我国甘肃、陕西、贵州、四川和山东山羊体内分离到CAEV[11-13]。1987～1995年间使用琼脂扩散检测方法(AGID)对我国17个省(区)的13个山羊品种共计21 169只(次)山羊的CAEV血清学调查,显示总阳性率3.33%,11个省(区)检出抗体阳性羊[14]。2018年,对我国11个省(区)2 083只山羊的调查显示抗体阳性率为0.38%,4个省(区)检出抗体阳性羊[15],有文献也显示中国台湾地区山羊的血清学阳性率[16]。CAEV在我国各地羊群中整体流行率仍较低。日本和西班牙南部的个体阳性率和场阳性率比例也有文献报道[17,18]。该病毒复制缓慢,经多年的隐性感染后最多30%的感染羊出现临床症状[5, 19]。

目前,CAEV/MVV总抗体检测试剂盒是用于区分CAEV感染山羊的主要方法之一。奶山羊感染山羊关节炎-脑炎病毒后总抗体转阳和抗体OD450值结果显示:CAEV山东株感染后第24 d时仅一只羊抗体转阳,直至第42 d时全部转阳;参考株(ATCC VR-905)感染后第24和28 d时各有一只羊抗体转阳,第三只羊在第42、58 d时仍为阴性,直至第71 d时抗体转阳。继续监测发现,抗体转阳后在余下的监测期内均为阳性。抗体水平动态曲线的非线性曲线模型拟合分析也显示各感染羊自抗体转阳后的整个监测期间其抗体值的95%置信带最低值和95%预测带最低值均高于阳性临界判定值;研究证实山羊感染CAEV后的抗体持续期可以长达5年以上[20],抗体转阳后的整个监测周期内均可使用检测CAEV总抗体的方法进行鉴别感染羊。同时,试验发现使用该方法对感染后30和45 d的山羊进行检测出现50%(3/6)和16.7%(1/6)的山羊判定为抗体阴性,即“假阴性”,山羊CAE检疫中,使用CAEV/MVV总抗体检测试剂盒(IDEXX)进行检测时,对抗体阴性山羊必须进行间隔期不少于60 d的2次以上的检疫才可判定为阴性。

4 结 论

山羊经颈静脉感染CAEV后45 d时约85%(5/6)的山羊血清总抗体转阳,71 d时所有感染山羊血清总抗体均转阳,其后200余天的检测期内抗体持续处在较高水平。检测山羊血清中CAEV总抗体水平适用于感染动物的判定,使用血清中总抗体水平检疫时,必须进行间隔期不少于60 d的2次以上的检疫方可确诊为阴性羊。