刘建菊　肖宁　吴云雨　蔡跃　潘存红　时薇　陈梓春　朱书豪　李育红　余玲　王志平　刘广青　周长海　黄年生　张小祥　季红娟　 李爱宏

摘要：基因编辑是一种能对特定基因进行修饰的基因工程技术，能快速对靶点基因编辑，是高效捕获目的基因、快速研究目标基因功能的重要手段，在基因功能研究和作物育种等方面有着重要意义和广阔的应用前景。基因编辑利用特异的DNA结合元件和切割元件开展编辑工作，然而该技术最需注意的是特异性和脱靶率问题，不同时期的基因编辑技术也针对上述2个问题进行改良，目前应用最为广泛的是CRISPR/Cas9，Cas12a 由于其特异性高且脱靶率大大降低也受到越来越多的关注。本文对基因编辑的技术发展及特点、CRISPR/Cas9和Cas12a的技术优势进行介绍，并对这2种技术在水稻产量、抗性及品质中的研究进展进行综述，同时对拓展CRISPR/Cas基因编辑技术在水稻中的应用提出展望，为基因功能鉴定及遗传改良提供参考。

关键词：基因编辑；Cas9；Cas12a；水稻；性状改良

中图分类号：S511.01文献标志码：A文章编号：1002-1302（2023）11-0001-09

基因编辑（gene editing）是一种能对特定基因进行修饰的基因工程技术［1-2］，该技术利用工程核酸酶切割目标基因组产生DNA双链断裂（DSB），进而激活细胞内源性DNA修复机制从而产生包括插入、缺失及基因片段替换等新的基因突变类型［3-5］。

1996年出现的锌指核酸酶（ZFN）为基因编辑技术的发展奠定了基础［6-7］，利用该技术首次于2002年果蝇染色体上实现基因定点突变［8］。随后转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）［9］及由RNA介导的Cas9蛋白相关的成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）相繼被发现［10-11］，特别是CRISPR/Cas9于2013年开始应用于植物基因组编辑，被Science列入2013年十大科学进展［10］。此外，用于切割双链DNA的CRISPR/Cas12a（Cpf1）［12-13］及在crRNA指导下切割ssRNA的CRISPR/Cas13（C2c2）［14］于2015年和2016年相继被发现（图1）。

基因编辑利用特异的DNA结合元件和切割元件开展编辑工作，然而该技术最需注意的是特异性和脱靶率问题，基因编辑技术的更迭对这2个方面的改善也各不相同（表1）。ZFNs是第一个应用于基因定点编辑的技术，然而其ZFN 剪切DNA 形成同源二聚体的同时，可能会产生异源二聚体引起脱靶且难以实现多靶点编辑等问题，严重阻碍了其应用［15-16］；TALENs技术是1个TALE基序识别1个碱基对，因此多个串联的TALE基序与其识别的碱基对呈一一对应关系，大大提高了编辑特异性并降低脱靶率，但其编辑效率较低，且难以进行多基因编辑［17-20］；CRISPR/Cas9技术在sgRNA的指导下与靶点结合，并利用HNH和RuvC对外源DNA进行切割，其编辑效率大大提高，且可以对多基因同时编辑，然而其缺点是靶向目标 DNA 序列容易出现错配，存在脱靶率高、编辑特异性低等缺陷［4，16，21-22］；Cas12a可以在crRNA引导下识别PAM，识别到正确序列才会形成封闭的R环，因此编辑准确性相对Cas9有了较大提高，其脱靶率也有所降低［12-13，23］。

CRISPR/Cas9及Cas12a是目前基因编辑技术中应用最为广泛的2种技术，在水稻产量、品质、生物胁迫及非生物胁迫性状关键基因的分子遗传功能解析和目标性状的精准改良上已成熟应用（表2）。

2CRISPR/Cas在水稻中的研究进展

2.1产量性状

水稻产量由单株穗数、每穗粒数、粒型及粒重等多个性状综合组成［112-113］。目前已有29个产量相关基因被编辑，其中4个基因对产量起正调控作用，其他25个基因均作为负调控因子发挥作用。Li等对每穗粒数Gn1a、粒型DEP1、粒重GS3及理想株型基因IPA1定点突变，gn1a、dep1和gs3的T2突变体出现穗粒数增加、粒型变大，成功提高了产量［37］。其他研究分别对Gn1a&DEP1、GS3&DEP1、GS3、GS2/GRF4及SPL16/qGW8等开展基因编辑，在穗粒数、粒型、粒重等性状上调控产量，改善农艺性状同时提高产量［39，42，44，47-48］。开展多基因同时编辑也可快速调控产量，Xu等同时对负调控粒重、粒型基因GS3、GW2、GW5及TGW6进行编辑，快速改良突变体粒重及产量［41］。Zhou等同时编辑GS3、Gn1a及GW2，相关突变体出现籽粒变大、穗粒数增多从而提高水稻产量［38］。Zeng等同时编辑PIN5b、GS3和MYB30，突变体兼顾了高产和耐冷性［43］。非产量调控基因突变也会提高产量，Miao等获得ABA受体突变体pyl1/4/6，通过增加31%籽粒数量从而提高产量［57］，除此之外，对FWL4、SD1（OsGA20ox2）及PYL9进行定点突变也可不同程度提高产量［49，51-52，58］。然而产量正调控基因如RGA1、SWEET11被编辑后会分别引起植株极端矮化及灌浆功能受损，从而减产［42，50］。

CRISPR/Cas12a在水稻产量调控中应用也日渐增多，Malzahn等对粒长基因DEP1和叶片卷曲度基因ROC5进行敲除提高产量。对水稻PDS、DEP 和ROC5基因所有靶点进行突变，能同时改良农艺性状及抗性［45，54］，而将叶绿素a加氧酶基因CAO1靶向敲入水稻中，突变体的产量及品质降低［32，53］，Zheng等同时利用Cas9和Cas12a对细胞分裂素家族基因OsCKX1-11进行编辑，获得了农艺性状及产量均有提升的单基因及多基因突变体，Cas9的编辑效率为26.9%～90.0%，有8个基因的编辑效率高于50.0%，而Cas12a的编辑效率为368%～100%且9个基因的编辑效率高于60%，Cas12a的多基因编辑效率高于Cas9（91.7%>545%）［40］。上述研究表明，对负调控基因进行定点突变后可快速获得目标性状改善的编辑系，然而有些基因突变后会对其他性状产生不利影响，因此多重基因编辑技术的应用为多个性状同时改良提供了方案和可行性，在开展基因编辑时Cas12a的编辑效率及稳定性均高于Cas9。

2.2品质性状

稻米品质是水稻商业价值的核心卖点，受到多个基因综合调控，已有大量基因被证实直接或间接调控稻米品质，可用于定向改良直链淀粉含量、蛋白、香味等性状。目前有13个品质基因被编辑，其中4个基因（ISA、ITPK、GL3.2和BEL）正调控稻米品质，其他基因负调控稻米品质。Wx基因的基因编辑位置差异对稻米品质影响不同，对Wx基因功能位点进行突变，可以将直链淀粉含量降至与糯稻相似，在不影响产量前提下改良稻米品质［59-61］；对 Wxb基因启动子转录因子结合位点进行突变，获得新的Wx等位基因并获得直链淀粉含量不同程度降低的突变体，改良了稻米品质［62］。fad2突变体的油酸浓度提高，gs9突变体的粒型、垩白及外观等品质显著改善，or突变体籽粒β-胡萝卜素含量显著提高，isa突变体总淀粉含量下调，ZmPsy和SSU-crtI突变体水稻的籽粒类胡萝卜素含量提高，badh2突变体籽粒产生香味，均可改良稻米品质［66-67，69-70，72，114］。多基因同時突变可综合提升水稻性状，如app6/10双突变体的直链淀粉、蛋白及谷蛋白含量均下调［65］；细胞色素P450家族基因（Os03g0603100、Os03g0568400和GL3.2）和香味基因BADH2同时突变后改良稻米香味并提高产量［71］；PDS和BELs同时突变稳定提高水稻产量和品质［73］。对正调控基因进行突变，有助于理解基因在稻米品质改良中的作用，敲除Wxb第一内含子、SBEIIb进行精准敲除，突变体直链淀粉含量上调，且引起营养特性改变［63-64］。Jiang等突变ITPK1-6，降低籽粒植酸含量然而却提高无机磷含量，不利于水稻生长繁殖，证实该基因对水稻正常生长发育的重要性［68］。对负调控稻米品质基因的敲除加速了优质水稻品种选育的进程，与其他产量性状相关基因同时编辑，有望在保证产量的同时提高品质。

2.3生物胁迫

水稻生长过程对生物胁迫的抗性也可利用基因编辑方法改良，对抗性相关基因MPK1、MPK2、MPK5和MPK6的敲除能够提高抗病性［85-86］。ERF922、SEC3A、ALB1、RSY1 和Pi21敲除后，突变体对稻瘟病的抗性提高，同时农艺性状也得到改良［74-78］。SWEET13和SWEET14敲除后突变体对白叶枯病菌的抗性提高，且SWEET14突变体无产量损失［79，81］。对SWEET11/8N3/Xa13编码区及启动子区定点突变，也能提高水稻对白叶枯病的抗性［80，82］。Liang等对稻曲病相关基因USTA和UvSLT2进行编辑，显著提高了水稻对稻曲病抗性［84］。利用Cas12a低水平同源性核酸酶MAD7对水稻基因EPSPS、NRAMP、PDS、Xa13及ALS等进行多重基因敲除，同步提升了突变体的品质、除草剂及白叶枯病抗性［83］。Wang等利用Cas12a对受体样激酶（OsRLK）相关基因（OsRLK-798、OsRLK-799、OsRLK-802和OsRLK-803）及CYP81A家族基因（OsBEL-230、OsBEL-240、OsBEL-250和OsBEL-260）开展多重基因编辑，获得了阳性植株，相关突变体调控了水稻的抗逆性［105］。

对水稻负调控抗性基因进行敲除或替换可快速改善目标性状，提升水稻抗性，然而有些编辑以损失产量为代价［109］，而有些编辑在不损害甚至优化农艺性状前提下同步改善水稻品质［77-78，81，90，95］，因此在进行水稻抗性改良时需要考虑基因对水稻的综合影响，从而制定相应编辑策略。

2.4非生物胁迫

水稻生长发育过程中会受到多种非生物胁迫的影响，如干旱、低温、盐、除草剂等，相关基因的大量挖掘促进了基因编辑在水稻非生物胁迫中的应用，目前有24个相关基因被编辑，其中8个基因起正调控作用，即Ann3、OTS1、RAV2、SAPK2、BELs、MKK5、RLKs和SAP。在水稻抗旱性方面，PYL9、ERA1、PDS、半卷叶基因（SRL1和SRL2）和MIR535的基因突变会增强突变体的抗旱性［58，88-90，106］。而敲除SAPK2和SAP基因后，突变体对干旱胁迫和活性氧更敏感，农艺性状显著下降［87，111］。在水稻响应盐胁迫方面，敲除水稻中的RR22、DST及PQT3基因，可显著提高耐盐性且不影响农艺性状［92，94-95］，但对OTS1编码区及RAV2启动子的GT-1元件突变后，其耐盐性下降［91，93］。在水稻抗除草剂方面，通过将EPSPS、ALS突变基因敲入，或点突变野生型基因（ALS、FTIP1e）均能使水稻获得除草剂抗性［96-103］。

除此之外，敲除Nramp5能降低Cd的积累且不影响产量［107-108］；Ann3敲除后对低温的耐受性降低［110］；敲除MKK5后，突变体抗逆性降低［104］；同时突变抽穗基因Hd2、Hd4和Hd5后突变体开花期及成熟期提前有助于逃避胁迫［109］，然而农艺性状受到较大影响，因此在应用时可进行单基因编辑，从而消除对产量的损害。

3CRISPR/Cas的技术展望

基因编辑技术为生命科学带来重大进展，然而几种技术的脱靶率及特异性问题仍需重点关注。研究人员优化了相关技术，开发了DB-PACE法从而降低基因编辑工具酶的脱靶效应，大大提高TALEN核酸酶的DNA结合能力和切割特异性［115］；开发出提高Cas9基因编辑和碱基编辑特异性的选择性核输出抑制剂（SINE）［116］；Sheng利用腙介导CRISPR/Cas12a系统，通过互补碱基配对引起的邻近效应来加速整个激活链的形成，从而提高Cas12a 系统的特异性［117］。除此之外，CRISPR系统的sgRNA的优化、PAM修饰、crRNA优化及Cas蛋白突变体挖掘也会进一步提高编辑范围及特异性并降低脱靶率［12，46，104，118-120］。此外Cas12a蛋白表现出对低温敏感的特征，目前Cas12a突变体是解决该问题的主要方式，而引起低温敏感的分子机制尚不明确。上述问题的解决，将大大提高基因编辑水平，对目标基因进行定向编辑，产生无外源DNA插入的新品种，从而加快育种速度、缩短育种年限。

水稻產量、抗性和品质相关基因的挖掘及分子机理解析，有助于更全面了解基因功能，目前基因编辑主要集中在编码区，有少量研究是编辑启动子的转录结合位点实现性状调控的。已有研究表明，DNA结构本身，如拓扑异构结构等也会影响基因表达水平［121］，因此，未来也可能作为基因编辑靶点，增加目标性状精准改良的可能性。随着人工智能的发展，Alphafold等技术对蛋白预测精准度提高，越来越多的蛋白结构被预测，对目标基因的模拟突变有助于挖掘关键碱基序列，可进行靶向预测，实现新的目标性状的改良已经成为可能。相信随着基因编辑技术的不断完善、生物信息学和人工智能的不断发展，水稻育种将会迅猛发展。

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