刘 奕 薛 毅 王小庆 龙苏舒 罗贤淑

(成都中储粮质量监督检测有限公司 610000)

呕吐毒素(DON)又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇,主要污染小麦、玉米、大麦等粮食作物及其制品。有研究表明呕吐毒素具有致畸、胚胎毒性,对心肌细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等也有一定的毒性[1]。粮食卫生标准GB 2761-2017中规定小麦中呕吐毒素限量为1000 μg/kg[2]。因此,小麦中呕吐毒素含量的检测成为中储粮粮食入库验收、销售出库以及产新调查的必检项目。

目前,GB 5009.111-2016中规定了呕吐毒素的检测方法有同位素稀释液相色谱-串联质谱法(LC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)和酶联免疫吸附筛查法(ELISA),另外还可以采用气相色谱法(GC)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)、胶体金免疫快速检测卡、红外光谱分析等方法检测[3,4]。薄层色谱法由于其操作繁琐、耗时长、灵敏度低和特异性差等特点现已很少采用;酶联免疫法虽然操作简单、分析时间短,但是特异性差、重复性差,结果存在一定的假阳性,适用于大批量样品的定性检测;免疫亲和层析净化—高效液相色谱法具有分析速度快、回收率高、准确性好、重复性好的优点,是目前实验室检测DON的重要手段[5,6]。本文优化了免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素的前处理步骤,建立了操作简便、准确性高、再现性好的呕吐毒素含量的测定方法,更适用于检化验室日常批量检验业务的开展。

1 试验方法

1.1 材料与试剂

呕吐毒素免疫亲和柱(1 mL柱管/支,柱容量>1000 ng);乙腈、甲醇(均为色谱纯),实验用水为UPR-2-10T超纯水设备制备的超纯水;全麦粉中呕吐毒素成分分析质控样品(编号TOXIN-JTZK-009,购于国家粮食和物资储备局科学研究院,标准值为800 μg/kg±120 μg/kg);乙腈中脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶液标准物质(浓度为100.7 μg/mL±3.2 μg/mL,购于国家粮食和物资储备局科学研究院)。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪,配紫外检测器(型号1260);离心机(型号TG16.5);多管涡旋混合器(型号SN-DMT-2500);固相萃取装置(型号LC-CQ-24F);超纯水设备(型号UPR-2-10T);电子天平(型号JJ500);自动分样器(型号JFYZ);水分磨(型号3310);混粉仪。

1.3 呕吐毒素标准溶液的制备

准确移取适量DON标准储备溶液(100.7 μg/mL)用流动相稀释,配置成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的标准系列工作液,4℃保存,有效期7 d。在上述色谱条件下,将标准系列工作液由低到高浓度依次进样检测,分别测定其保留时间和峰面积。以呕吐毒素标准工作液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,作出标准曲线见图1,并得到标准曲线回归方程,如表1所示。

图1 呕吐毒素标准曲线

表1 呕吐毒素标准工作液不同浓度对应的峰面积

1.4 试样的制备

试样采用全自动分样器混匀5遍后,每份缩分至500 g±50 g,拣出杂质、矿物质得到净粮,用水分磨碾磨后,于混粉器中混匀30 min。称取5 g磨碎的试样于50 mL离心管中,加入25 mL水提取,置于多管涡旋振荡器中2500 r/min涡旋20 min,6000 r/min离心10 min,上清液备用。取2.5 mL上清液直接过免疫亲和柱,加水10 mL淋洗。吹干免疫亲和柱,用1.5 mL甲醇洗脱亲和柱,在洗脱液中加入0.5 mL超纯水,涡旋混匀30 s后过0.45 μm有机滤膜,收集滤液于进样瓶中待测。

1.5 测定条件

色谱柱:岛津C18柱(250 mm、4.6 mm、5 μm);流动相为10%乙腈-水;流速1 mL/min;柱温40℃;进样量20 μL;检测器为紫外检测器,波长218 nm。

2 结果与分析

2.1 灵敏度、检出限、定量限

由表1可知,呕吐毒素在100 ng/mL～5000 ng/mL浓度范围内线性关系良好,其线性回归方程为y=0.0741x,R2=0.99996。根据GB/T 5009.1-2003附录A对灵敏度的规定:把标准曲线回归方程的斜率b作为方法的灵敏度,因此,该方法检测呕吐毒素的灵敏度为0.0741。用浓度为100 ng/mL的呕吐毒素标准溶液进行进样分析,信噪比为320.4,由计算得出呕吐毒素检出限为1.873 μg/kg,定量限为6.243 μg/kg,均能满足GB 5009.111-2016要求。

2.2 精密度

选择浓度为1000 ng/mL的呕吐毒素标准溶液进行5次测量,其结果见表2。

表2 精密度测试

由表2可知,根据GB/T 32465-2016(7.4)对精密度的要求,实验条件下检测呕吐毒素的相对标准偏差、相对极差均符合实验要求。

2.3 回收率

0.5 kg小麦用水分磨粉碎,过粒径小于2 mm孔径试验筛,混合均匀,称取四组双平行试样5 g(精确到0.01 g),一组为样品空白,其余三组添加三个不同浓度梯度的标准溶液,换算为理论添加值,按上述方法进行呕吐毒素含量测定,用加标回收实验验证方法的回收率,结果见表3。

表3 呕吐毒素回收率测定结果

表3的结果表明,按不同水平定量添加呕吐毒素标准溶液的回收率在99.90%～107.42%,平均回收率为102.9%,标准偏差为2.1%,相对标准偏差(RSD)为2.0%,符合GB/T 32465-2015(7.3)对检测方法准确性要求。

2.4 质控样品的测定

取呕吐毒素质控样品按照上述方法做1组双试验,测定结果分别为837和723,2次测定结果均在标准值允差范围内,精密度满足GB 5009.111-2016要求。质控样品的液相图谱如图1及图2所示。由图1及图2可以看出,质控样品经过免疫亲和柱净化后的峰形较好,无明显杂质峰,这说明经过优化后的实验方法是可行的。

图1 质控样品呕吐毒素检测色谱图1

图2 质控样品呕吐毒素检测色谱图2

3 结论

采用优化后的免疫亲和柱净化高效液相色谱法检测小麦中的呕吐毒素,方法的检出限为1.873 μg/kg,平均回收率在99.90%～107.42%。样品的前处理过程不需要添加聚乙二醇及PBS缓冲盐溶液,不需要氮吹过程,因此可有效避免氮吹时的压力、温度以及时间对待测成分可能带来的影响。前处理操作更加简化经济,具有高效、准确、灵敏度高的优点,适用于粮油检测机构日常检验工作的开展。