王天光,陈泽伦,赵朝阳,王石坚,葛广全

心力衰竭(heart failure,HF)是指各种原因引起心排血量减少,不足以提供组织代谢的一种复杂综合征,是多数心脏疾病的共同转归,是导致病人死亡的关键因素[1]。相关研究显示,HF的发生与心肌细胞凋亡密切相关,HF可促进心肌细胞凋亡,而心肌细胞凋亡又可加速HF进展[2-3]。因此,寻找有效的药物抑制HF过程中心肌细胞凋亡尤为重要。益母草碱是临床常用中药材益母草的主要有效成分,具有抗氧化、活血化瘀、抗血小板聚集、利水消肿、保护心血管等功效[4-5]。有研究显示,益母草碱可抑制HF大鼠心肌重构,改善心功能[6]。关于益母草碱对HF过程中心肌细胞凋亡的影响及作用机制尚未明确。

核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一种作用广泛的核转录因子,参与免疫应答、炎症反应、应激反应、细胞凋亡等病理、生理过程中相关基因的调控。多项研究显示,NF-κB活化可诱导心肌细胞凋亡[7-8]。细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,活化的ERK可激活NF-κB,进而调节基因表达[9-10]。然而,益母草碱能否调控ERK/NF-κB信号通路尚未明确。基于此,本研究采用腹腔注射阿霉素(adriamycin,ADR)法建立HF大鼠模型,观察益母草碱对HF大鼠心肌细胞凋亡的影响,探讨ERK/NF-κB信号通路作为益母草碱药理机制的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性无特定病原体(SPF)级SD大鼠,6～7周龄,体质量210～230 g,购自北京华阜康生物公司,使其稳定、适应3 d后再进行实验,温度22～25 ℃,湿度45%～55%,光照12 h/黑暗12 h交替模式,大鼠自由饮食、进水。

1.2 实验试剂与仪器 益母草碱(货号SND-5171,滁州仕诺达生物科技公司);ADR(货号D8740,Solarbio公司);ERK抑制剂(PD98059)(货号HY-12028,MedChemExpress公司);末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测试剂盒、RIPA裂解液(货号分别为C1091、P0013B,Beyotime公司);核蛋白抽提试剂盒(货号R0050,Solarbio公司);兔抗大鼠一抗anti-NF-κB p65(货号sc-8008,Santa Cruz公司);兔抗大鼠一抗anti-B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)、anti-Bcl-2相关X蛋白(Bax)、anti-GAPDH、anti-Histone H3、anti-ERK、anti-磷酸化ERK(p-ERK)、anti-NF-κB抑制蛋白(IκB)α、anti-磷酸化IκBα(p-IκBα)及山羊抗兔二抗(货号分别为ab196495、ab32503、ab181602、ab1791、ab184699、ab201015、ab32518、ab133462、ab6721,Abcam公司)。

动物彩色多普勒超声仪(动物彩超机)(型号MyLabTMSigma VET,上海玉研科学仪器公司);光学显微镜(型号Olympus CX43,上海通灏光电科技公司);石蜡包埋机、切片机(型号分别为HS-B7126-B、HS-S7220-B,沈阳恒松科技公司);凝胶成像系统(型号Invitrogen®E-Gel Imager,广州市科之蓝仪器公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立HF模型 参照相关文献[11],采用腹腔注射ADR法建立HF模型。腹腔注射ADR(0.8 mg/mL),总剂量15 mg/kg,前3周3 mg/kg,后3周2 mg/kg,每周1次。Control组腹腔注射等体积的生理盐水。6周后采用动物彩超机测定大鼠左室射血分数(LVEF),LVEF<45%即为HF模型建立成功。

1.3.2 实验分组及给药干预 随机将HF模型大鼠分为HF组、低剂量益母草碱(L-益母草碱)组[益母草碱剂量为7.5 mg/(kg·d),灌胃给药]、高剂量益母草碱(H-益母草碱)组[益母草碱剂量为30 mg/(kg·d),灌胃给药]及ERK抑制剂组[PD98059 10 mg/(kg·d),腹腔注射][6],每组8只;另取正常SD大鼠8只作为Control组。根据分组进行给药干预,每日1次,连续14 d,Control组、HF组灌胃等体积的生理盐水。

1.3.3 动物彩超机测定心功能指标 末次给药24 h后,腹腔注射2%的戊巴比妥钠使大鼠轻度麻醉,对胸部进行消毒、备皮,连接动物彩超机,测定LVEF、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(LVFS)变化。

心功能指标检测结束后处死大鼠,取出心脏,清洗后切取部分心肌组织,将其置于4%多聚甲醛中固定20 h,经脱水、透明后进行石蜡包埋,制作成4 μm厚的切片用于TUNEL染色、免疫组化实验。剩余心肌组织-80 ℃保存备用。

1.3.4 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 取制备好的切片,经常规脱蜡至水处理后,依次浸于蛋白酶K溶液、3%过氧化氢(H2O2)溶液中,之后依次孵育TUNEL反应液(37 ℃,60 min)、反应终止液(室温20 min),辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin(室温30 min),最后滴加3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色液,光学显微镜下观察心肌细胞凋亡情况,并计算凋亡率。

1.3.5 免疫组化法测定心肌组织凋亡相关蛋白表达 取制备好的切片,经常规脱蜡至水处理后进行抗原修复,之后经3%H2O2溶液、血清封闭液中浸泡处理,依次孵育一抗anti-Bcl-2、anti-Bax(4 ℃过夜)、二抗(37 ℃,30 min)、DAB显色液(室温5 min),之后经苏木精浸染、透明、脱水、封片,光学显微镜下观察Bcl-2、Bax表达情况并拍照,使用Image J软件进行定量分析。

1.3.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织ERK/NF-κB信号通路相关蛋白表达 取保存的心肌组织,解冻后分别提取总蛋白(RIPA裂解液)与核蛋白(核蛋白抽提试剂盒),采用二喹啉甲酸法(BCA)试剂盒测定蛋白浓度、Lodding Buffer进行定量,通过凝胶电泳分离蛋白,之后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h后孵育一抗anti-GAPDH、anti-Histone H3、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-IκBα、anti-NF-κB p65(4 ℃过夜),次日孵育二抗(室温2 h),加入显色剂后置于凝胶成像系统中拍照,使用Image J软件进行定量分析。

2 结 果

2.1 各组心功能指标变化 与Control组比较,HF组LVEF、LVFS均减少,LVESD、LVEDD均增加(P<0.05);与HF组比较,L-益母草碱组、H-益母草碱组、ERK抑制剂组LVEF、LVFS均增加,LVESD、LVEDD均减少(P<0.05)。与L-益母草碱组比较,H-益母草碱组、ERK抑制剂组LVEF、LVFS均增加,LVESD、LVEDD均减少(P<0.05)。详见表1。

表1 各组心功能指标变化(±s)

2.2 各组心肌细胞凋亡情况 与Control组比较,HF组心肌细胞凋亡率增加(P<0.05);与HF组比较,L-益母草碱组、H-益母草碱组、ERK抑制剂组心肌细胞凋亡率减少(P<0.05);与L-益母草碱组比较,H-益母草碱组、ERK抑制剂组心肌细胞凋亡率减少(P<0.05)。详见图1、表2。

图1 各组心肌组织TUNEL染色图(×400)

表2 各组心肌细胞凋亡率比较(±s) 单位:%

2.3 各组心肌组织凋亡相关蛋白表达情况 与Control组比较,HF组心肌组织Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加(P<0.05);与HF组比较,L-益母草碱组、H-益母草碱组、ERK抑制剂组心肌组织Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达减少(P<0.05);与H-益母草碱组比较,H-益母草碱组、ERK抑制剂组心肌组织Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达减少(P<0.05)。详见图2、表3。

图2 各组心肌组织凋亡相关蛋白免疫组化图(×200)

表3 各组心肌组织凋亡相关蛋白表达比较(±s)

2.4 各组心肌组织ERK/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 与Control组比较,HF组心肌组织p-ERK、p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白表达均增加(P<0.05);与HF组比较,H-益母草碱组、ERK抑制剂组心肌组织p-ERK、p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白表达均减少(P<0.05)。详见图3、表4。

图3 各组心肌组织ERK/NF-κB信号通路相关蛋白条带图

表4 各组心肌组织ERK/NF-κB信号通路相关蛋白表达比较(±s)

3 讨 论

HF发病机制多且复杂,其中心肌细胞凋亡发挥着重要作用,贯穿HF整个过程,导致心肌细胞进行性丢失,久之使心肌收缩功能障碍,发展为HF[12]。调控心肌细胞凋亡的众多因子中Bax、Bcl-2为经典因子,其中Bax是一种促凋亡蛋白,以Bax-Bax同源二聚体的形式插入至线粒体外膜中,形成微孔结构,从而使线粒体内的凋亡因子外溢,引发细胞凋亡;Bcl-2是一种抗凋亡蛋白,可竞争性地与Bax结合,抑制Bax-Bax同源二聚体微孔结构形成,从而抑制细胞凋亡[13-14]。

益母草碱是从中药材益母草中分离、提取的一种生物碱,为益母草的有效成分,最初作为一种妇科常用药而被熟知,随着对其的深入研究,发现益母草碱具有显著的保护心血管作用[15-16]。有研究将益母草碱应用于HF大鼠,结果发现,HF大鼠心肌重构、心功能均得到了明显改善[6]。目前关于益母草碱对HF过程中心肌细胞凋亡的影响及相关作用机制尚未明确。本研究结果显示,与Control组比较,HF组LVEF、LVFS及心肌组织Bcl-2蛋白表达均减少,LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及心肌组织Bax蛋白表达均增加,表明HF大鼠心肌细胞凋亡显著,且心功能变差;经L-益母草碱、H-益母草碱干预后,上述情况均改善,且H-益母草碱效果更佳,表明益母草碱可抑制HF大鼠心肌细胞凋亡,改善心功能,且高剂量效果更佳,故选取H-益母草碱探讨药理机制。

NF-κB是重要的核转录因子之一,与心肌细胞凋亡的发生关系密切,正常情况下,NF-κB以二聚体的形式与IκBα结合存在于细胞质中,当细胞受到刺激时,IκBα发生磷酸化使NF-κB解离、活化并移位至细胞核内,从而调控Bax、Bcl-2等相关凋亡基因表达,诱导心肌细胞凋亡[17-18]。ERK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的一员,多项研究显示,ERK通过磷酸化活化之后可激活NF-κB[19-20]。本研究结果显示,与Control组比较,HF组心肌组织p-ERK、p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白水平均增加,表明ERK/NF-κB信号通路激活参与HF大鼠心肌细胞凋亡的发生;经H-益母草碱干预后,HF大鼠心肌组织p-ERK、p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白水平均降低,表明益母草碱可抑制ERK/NF-κB信号通路激活。然而,益母草碱能否通过抑制ERK/NF-κB信号通路激活,抑制HF大鼠心肌细胞凋亡尚未明确。由于无合适的ERK激活剂,本研究设置ERK抑制剂干预为平行对照组,结果显示,抑制ERK/NF-κB信号通路激活后,HF大鼠心肌细胞凋亡率降低,心功能明显改善,效果与高剂量益母草碱相当。结合相关研究结果,推测抑制ERK/NF-κB信号通路激活可能为益母草碱的药理机制。

综上所述,益母草碱可抑制HF大鼠心肌细胞凋亡,改善心功能,可能通过抑制ERK/NF-κB信号通路激活而实现,本研究结果可为治疗HF提供实验依据。