孙晓虹, 葛小霞, 阿力木·吾甫尔

(新疆医科大学第一附属医院1健康管理中心, 2神经内科, 乌鲁木齐 830054)

甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是脂溶性苯丙胺类精神兴奋剂,易透过血脑屏障损伤中枢神经系统,长期滥用METH可导致幻听、幻视、焦虑、抑郁等行为及精神障碍,滥用人群低龄化,对社会具有一定的危害性[1-2]。目前有关METH神经毒性作用机制尚未完全阐明,临床仍缺乏有效防治药物。金雀异黄酮(Genistein,GEN)提取自大豆、小麦、玉米等植物,是大豆异黄酮的主要成分,约占大豆异黄酮总含量的60%,在抑制细胞凋亡、减少神经炎症等方面有重要作用[3]。林志军等[4]研究显示,GEN可有效抑制心肌细胞缺血再灌注模型的氧化应激损伤,发挥保护作用。目前关于GEN对METH诱导的神经细胞损伤的影响及其作用机制尚不清楚。有研究表明,METH诱导的神经细胞损伤与氧化应激关系密切[5],GEN能否通过氧化应激途径修复神经细胞损伤尚不可知,因此本研究探寻GEN对METH诱导的神经细胞损伤及氧化应激的影响及可能的机制,为临床防治METH神经毒性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞(北京百欧博伟生物技术有限公司);GEN,纯度>98%(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,C1431128);甲基苯丙胺,纯度≥99.8%(北京北方伟业计量技术研究院,107762);阿立哌唑口腔崩解片(成都康弘药业集团股份有限公司,国药准字:H20041501);DMEM培养基(3-2020)、四唑盐(MTT,0793-5G)均购自美国Sigma公司;AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(上海抚生实业有限公司,FS-79505);超氧化物歧化酶试剂盒(SOD,FT-D23758)、丙二醛试剂盒(MDA,BC0025-100)均购自上海梵态生物科技有限公司;活性氧(ROS)含量测定试剂盒(上海将来实业股份有限公司,YT6089);兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2,Ab32124)、核因子E2相关因子2(Nrf2,Ab137550)、血红素加氧酶-1(HO-1,Ab13248)均购自美国Abcam公司。兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗(K001593P)、HRP标记山羊抗兔二抗(K006153P)均购自亚科因(武汉)生物技术有限公司。CO2培养箱(日本sanyo公司,NHD DYE1738型);Elx800酶标仪(美国Thermo公司,HSG9832型);流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司,CytoFLEX SRT型)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 用含10%灭活胎牛血清(FBS)、青链霉素的DMEM培养基培养PC12细胞,培养条件:37℃、5%CO2、95%饱和湿度。取对数生长期的PC12细胞,以2.5×105/mL密度接种于24孔板,待融合80%左右时,更换无FBS的培养基,并随机分为5组,每组设6个复孔。空白对照组PC12细胞不做任何处理,用无FBS培养基继续培养24 h;METH组用终浓度为3 mmol/L METH溶液[6]的无FBS培养基继续培养24 h;GEN低、中、高剂量组用终浓度为1、10、100 μmol/L GEN溶液[7]处理细胞后,置于终浓度为3 mmol/L METH溶液的无FBS培养基继续培养24 h;阳性对照组用含终浓度为20 μmol/L阿立哌唑溶液[3]处理细胞后,置于终浓度为3 mmol/L METH溶液的无FBS培养基继续培养24 h。所有实验重复6次。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 将细胞以2.5×105/mL密度接种至24孔板,继续培养24 h,各孔加MTT(20 μL,5 g/L),继续培养4 h后,加入5 mg/mL浓度的二甲基亚砜溶液150 μL,振荡、溶解。测定490 nm处各孔细胞光密度值(OD490 nm),细胞存活率即为各试验孔OD值占空白对照组OD值的百分比。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集各组细胞,按照凋亡试剂盒说明书,以5 μL碘化丙啶(PI)+5 μL异硫氰酸荧光黄(AnnexinV-FITC)双染试剂,避光孵育20～25 min、稀释后,1 h内上机检测,仪器读取凋亡率数值。

1.2.4 ELISA检测氧化应激水平 收集各组细胞及上清液,加入裂解液后立即根据ROS试剂盒说明书检测待测样本ROS含量;取上清8 000 r/min,离心15 min,采用SOD、MDA试剂盒检测待测样本SOD、MDA含量。

1.2.5 免疫印迹法检测Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达情况 收集各组细胞,裂解,提取总蛋白,行电泳,转膜,加入封闭液25℃封闭2 h,加入一抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、内参β-actin(1∶500),4℃过夜,加入HRP标记二抗(1∶1 000稀释),25℃孵育1.5 h,显影、定影,计算目的蛋白与内参β-actin的相对表达量。

2 结果

2.1 各组PC12细胞增殖情况比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞存活率降低(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组PC12细胞存活率升高(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组PC12细胞存活率降低(P<0.05),GEN高剂量组PC12细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05);PC12细胞存活率呈剂量依赖性升高(P<0.05),见表1。

表1 各组PC12细胞增殖抑制率比较

2.2 各组PC12细胞凋亡情况比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞凋亡率升高(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组PC12细胞凋亡率降低(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组PC12细胞凋亡率升高(P<0.05),GEN高剂量组PC12细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);PC12细胞凋亡率呈剂量依赖性降低(P<0.05),见图1、表2。

注:A,空白对照组;B,METH组;C,GEN低剂量组;D,GEN中剂量组;E,GEN高剂量组;F,阳性对照组。图1 各组PC12细胞凋亡情况比较

表2 各组PC12细胞凋亡情况比较

2.3 各组PC12细胞氧化应激水平比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞SOD活性降低,MDA含量、ROS水平均升高(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组SOD活性升高,MDA含量、ROS水平降低(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组SOD活性降低,MDA含量、ROS水平升高(P<0.05);GEN高剂量组SOD、MDA、ROS差异无统计学意义(P>0.05);SOD活性呈剂量依赖性升高,MDA含量、ROS水平呈剂量依赖性降低(P<0.05),见表3。

表3 各组PC12细胞氧化应激水平比较

2.4 各组PC12细胞凋亡蛋白表达比较与空白对照组比较,METH组Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),GEN高剂量组Bax、Bcl-2蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);Bax蛋白水平呈剂量依赖性降低,Bcl-2蛋白水平呈剂量依赖性升高(P<0.05),见表4。

表4 各组PC12细胞凋亡蛋白表达比较

2.5 PC12细胞Nrf2/HO-1通路蛋白表达比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组和阳性对照组Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05),GEN高剂量组Nrf2、HO-1蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);Nrf2、HO-1蛋白水平呈剂量依赖性升高(P<0.05),见表5。

表5 各组PC12细胞Nrf2/HO-1通路蛋白表达比较

3 讨论

METH俗称"冰毒",无色、无臭,属于苯丙胺类中枢神经兴奋剂。METH极易透过血脑屏障并选择性作用于中枢神经系统损害中枢神经,造成幻听、幻视等精神分裂阳性症状及冲动、焦虑等,给滥用者身体及精神造成严重伤害,甚至造成刑事犯罪,危害社会公共安全[8]。阿立哌唑属于脂溶性喹诺啉酮类衍生物,是一种抗精神病药物。研究显示,阿立哌唑对神经细胞损伤具有保护作用,但也具有一定的副作用[9]。因此寻找有效且副作用少的戒毒药物具有重要社会意义。GEN是一种三羟基异黄酮,其在细胞缺血再灌注损伤修复、氧化应激调控中的作用日益受到关注[10]。研究显示[11],GEN对叔丁基过氧化氢诱导的心肌细胞H9c2衰老模型有显著的保护作用,其机制与提高细胞的抗氧化能力有关。高华武等[12]研究发现,GEN可通过调控钙离子通道相关蛋白表达,促进海马神经元损伤修复进程。引发神经元细胞凋亡是METH神经毒性作用机制之一[13]。多项研究证实,Bcl-2和Bax参与脑神经细胞损伤,且可受机体内的ROS、DNA损伤等氧化应激因素刺激,使Bax与Bcl-2表达失衡,参与调控神经细胞凋亡[14-15]。本研究以不同剂量GEN处理后,PC12细胞存活率升高,凋亡率降低,且Bax蛋白下调,Bcl-2蛋白上调,且具有剂量依赖性,高剂量组与阳性对照组无差异,说明GEN可能促进METH诱导的PC12细胞增殖并抑制细胞凋亡,对神经细胞损伤发挥保护作用。

多巴胺神经元氧化应激损伤可能是METH细胞毒作用机制之一[16]。本研究以不同剂量GEN处理后,PC12细胞SOD活性升高,MDA、ROS水平降低,呈剂量依赖性。SOD与MDA水平可间接反映细胞氧化应激损伤程度[17-18]。龚晓康等[19]研究显示,METH可促进小鼠脑区氧化应激损伤学习记忆,其在动物体内水平的研究结果与本研究一致。说明GEN可能通过抑制METH诱导的氧化应激损伤,进而促进PC12细胞增殖并抑制凋亡。范勇等[20]研究发现,GEN可通过调控海马神经元自噬水平保护创伤应激障碍大鼠神经损伤,但具体机制尚不明确。Nrf2是一种抗氧化剂,当氧化应激信号刺激组织器官时,Nrf2转移至细胞核与下游的多效靶基因相结合发生转录反应,产生HO-1、SOD等抗氧化物酶,能够有效清除细胞内的氧自由基,进而抑制细胞氧化应激损伤导致的细胞凋亡[21]。林斯革等[22]研究显示,促进Nrf2/HO-1通路活化可对脑缺血再灌注后神经元损伤发挥保护作用。本研究以不同剂量GEN处理后的PC12细胞Nrf2、HO-1蛋白水平升高,呈剂量依赖性,高剂量组与阳性对照组无差异。说明GEN能促进METH诱导的PC12细胞增殖并抑制细胞凋亡,对神经细胞发挥保护作用,可能是通过促进Nrf2/HO-1通路活化抑制氧化应激损伤实现的。

综上所述,GEN能促进METH诱导的PC12细胞增殖并抑制细胞凋亡,可能对神经细胞发挥保护作用,且可能与促进Nrf2/HO-1通路活化抑制氧化应激损伤有关。然而本研究并未能明确Nrf2/HO-1通路在METH诱导的PC12细胞损伤中的具体作用机制,后期有待进一步研究。