李玉梅

南阳市第一人民医院病理科 (河南 南阳 473000)

胰腺癌是最难治疗的人类癌症之一，其中胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcino-ma，PDAC)约占诊断病例的85%，预后很差，据报道，中国上海胰腺癌的总生存期非常差，中位生存期仅为7-8个月，1年和5年生存率分别为35.0%和4.4%[1]。尽管PDAC的治疗取得了一些进展，但是并未使患者的预后有显著改观。当前迫切需要确定肿瘤生长的潜在机制，以进行早期诊断和精准治疗[2]。蛋白激酶在调节细胞内信号转导通路中起着关键作用，几乎涉及细胞活动的各个方面，包括增殖、存活、分化、凋亡、代谢、血管生成、免疫监视和运动[3]。狐猴酪氨酸激酶3(lemur tyrosine kinase 3，LMTK3)为丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸激酶家族中的一员，近年研究表明其与甲状腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、前列腺癌等实体癌关系密切[4]，但与PDAC的关系尚缺乏研究。Caspase属于白细胞介素-1b转换酶家族，也称为半胱氨酸蛋白酶，在诱导细胞凋亡中起重要作用。哺乳动物中的caspase家族有14个成员，大多数成员在细胞存活、增殖、分化或炎症中发挥功能[5]。本研究旨在探讨胰腺导管腺癌中LMTK3、caspase 3、caspase 7的临床表达意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象前瞻性选择2017年1月至2021年4月83例胰腺导管腺癌患者作为研究对象，均为首次发现胰腺占位，并经手术病理学检查证实，术前未进行放化疗及生物治疗。排除临床资料不完整者。男49例，女34例；年龄36～78岁，平均年龄(61.72±8.16)岁。本研究经患者及家属同意，经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1主要实验试剂 兔抗人多克隆抗体 LMTK3、兔抗人多克隆抗体 caspase-3、兔抗人多克隆抗体Caspase-7及免疫组织化学检测试剂盒均购自Sigma公司；DAB显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PBS缓冲液、3%H2O2溶液均自行配置。

1.2.2 免疫组织化学法 所有患者均收集癌组织和癌旁正常组织，经10%甲醛固定，脱水、石蜡包埋后行3μm连续切片，然后置于60℃烤箱2h，脱蜡、柠檬酸盐抗原修复，每片予3%H2O250mL，PBS洗3次，分别滴加LMTK3、caspase 3、caspase 7兔抗人多克隆抗体(1:400稀释)，按试剂盒说明书进行操作，4℃下孵育过夜，复温20min，DAB 显色，苏木素复染，盐酸酒精进行分色，在光学显微镜下观察 LMTK3、caspase 3、caspase 7的表达情况。1.2.3 结果判读 每张切片随机选择5个视野，每个视野至少计数300个，LMTK3阳性为胞浆着色，caspase-3和caspase-7阳性均为细胞质着色。着色细胞百分比计分标准：阳性细胞比例≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。染色强度计分标准：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分相加进行综合判断：1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为(++)，6～7分(+++)，将(-)和(+)归于低表达，(++)和(+++)为高表达。

1.2.4 随访 所有患者均进行门诊或电话随访追踪，截止2022年6月，中位随访期为16个月。其中存活39例，死亡44例。

1.3 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件，计数资料以率表示，组间比较用χ2检验。相关性采用Spearman相关分析。P＜0.05表示有统计学意义。

2.1 LMTK3、caspase 3、caspase 7在不同胰腺组织中的表达与癌旁正常组织比较，癌组织中的LMTK3高表达率明显提高(P＜0.05)，而caspase 3和caspase 7高表达率明显降低(P＜0.05)，见表1。相关性分析显示，癌组织中LMTK3的表达与caspase 3、caspase 7均呈负相关(r=-0.628、-0.697，P=0.021、0.015)，caspase 3与caspase 7呈正相关(r=0.847，P=0.006)。

表1 LMTK3、caspase 3、caspase 7在不同胰腺组织中的表达[n(%)]

2.2 LMTK3、caspase 3、caspase 7与胰腺导管腺癌临床病理特征之间的关系LMTK3的表达与胰腺导管腺癌的临床病理特征之间均无明显关系(P＞0.05)，caspase 3的表达与年龄、有无神经侵犯有关(P＜0.05)，caspase 7的表达与肿瘤直径、有无淋巴结转移有关(P＜0.05)，见表2。

表2 LMTK3、caspase 3、caspase 7与胰腺导管腺癌临床病理特征之间的关系[n(%)]

2.3 LMTK3、caspase 3、caspase 7的表达与胰腺导管腺癌预后的关系存活患者与死亡患者 LMTK3、caspase 3、caspase 7的表达均无明显差异(P＞0.05)，见表3。

表3 LMTK3、caspase 3、caspase 7与胰腺导管腺癌预后的关系

2 结 果

3 讨 论

LMTK3在一些癌症中的应用前景十分可观，尤其是在乳腺癌中，LMTK3磷酸化和调节雌激素受体-α的活性对雌激素受体阳性细胞的生长至关重要，被确定为辅助性乳腺癌内分泌治疗耐药相关的调节靶点[6]。LMTK3可以催化蛋白质磷酸化，直接或间接参与多种细胞信号通路的转导，如雌激素受体通路、Wnt信号通路和叉头盒O3通路等[4-6]。然而其在PDAC中的生物学作用尚不清楚。在这项研究中，我们证明LMTK3在PDAC中呈过度表达，亦提示LMTK3在PDAC中扮演着致癌性的角色。以往研究表明，LMTK3的高表达往往与肿瘤的发生、进展和预后显著相关，LMTK3的过表达加速了肿瘤细胞的分散和侵袭，这是转移过程的第一步[4,7]。然而我们的研究结果却显示LMTK3与PDAC患者的临床病理特征均无关，这无法进一步证明LMTK3对PDAC的生物学行为具有促进作用，并且存活者和死亡者的LMTK3表达亦无明显差异，这使得LMTK3对PDAC的意义与价值显得苍白，与我们的期望有一定偏差。由于目前尚无LMTK3与胰腺癌关系的研究，故无法与其他研究形成对比。

强有力的证据表明，肿瘤生长不仅是细胞增殖失控的结果，也是细胞凋亡减少的结果。细胞凋亡是一个基本而复杂的生物学过程，caspase因诱导细胞凋亡功能为闻名。在哺乳动物中，caspase在蛋白酶级联中被激活，导致关键结构蛋白和重要信号、稳态和修复酶的异常激活或快速失能[8]。Caspase-3处在Caspase级联反应的最下游，是caspase家族中最主要的执行蛋白酶之一，可由内在(线粒体)和外在(死亡配体)途径激活，通过降解底物诱导细胞凋亡。Caspase-3在胰腺癌中的表达情况仍存在争议，蒲竞等[9]研究显示，caspase-3在胰腺癌与癌旁组织中的表达并无明显差异，且肿瘤分化越低，越容易呈现为强阳性表达。赵甦等[10]研究显示，caspase 3在胰腺癌组织中的表达远高于癌旁组织，并认为caspase 3对胰腺癌的影响主要在于早期，对后续临床分期的进展影响较小。而本研究却显示，caspase 3在胰腺癌组织中的表达低于癌旁组织，提示caspase 3在胰腺癌中的表达受到抑制。至于其是如何受到抑制的尚不清楚，可能与炎症环境有关。动物实验表明，白细胞介素-6可通过下调Caspase-3和Bax的表达，上调Bcl-2的表达，调控细胞凋亡信号通路，促进胰腺癌生长增殖[11]。caspase 3的表达受到抑制，凋亡信号途径受影响，导致肿瘤细胞的凋亡减少，从而促使PDAC的发生和发展。有神经侵犯者，caspase 3的表达明显低于无神经侵犯者，可见caspase 3的表达受抑制对PDAC的生物学行为具有促进作用。此外，年龄也可能影响caspase 3的表达，但其中的机理不清楚。不过遗憾的是，caspase 3对预测PDAC的预后似乎无较大价值。

另一种caspase家族成员caspase 7在细胞凋亡中亦起到主导作用[12]，本结果提示它也参与了PDAC的发生，并且与caspase 3的表达呈明显正相关，二者在PDAC的发生中具有协同作用。随着肿瘤直径的增大以及发生淋巴结转移，caspase 7的表达会随之降低。同样它的表达水平并不会影响PDAC患者的预后。尽管相关性分析，LMTK3、caspase 3、caspase 7三者之间在PDAC中的表达均具有相关性，但相对而言，caspase 3和caspase 7与PDAC的关系似乎比LMTK3与PDAC的关系更密切，在PDAC中，caspase 3和caspase 7可能更具有开发价值。

综上所述，LMTK3、caspase 3、caspase 7是否有望成为PDAC的干预靶点仍需大量深入研究。