袁 丹, 袁茂莎, 石婷婷, 蒙泽飞, 刘英渠

(1. 贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵州 贵阳 550025;2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵州 贵阳 550025)

不同品种的香猪毛色和皮肤颜色各有差异,有“六白”或“不完全六白”的从江香猪、“两头乌”的剑白香猪、“全黑”“六白”或“不完全六白”的久仰香猪、“全黑”的环江香猪4个类型[1]。毛色和皮肤颜色的遗传在家畜育种过程中一直备受关注,毛色和皮肤颜色被视为1个品种的主要特征。基因控制色素的形成和类型,从而决定动物的毛色和皮肤颜色。不同种属动物的毛色和皮肤颜色由多个基因决定,并且能够通过彼此间相互作用控制色素的产生[2]。MicroRNA(miRNA)是1类约22个核苷酸的非编码单链RNA序列,在生物体内以多种方式存在[3]。miRNA通过与其靶基因的3’UTR端位点相结合,抑制或降解靶基因的表达,从而参与多种生物学过程的调控[4]。Quah S等[5]发现miR-615的主要产物可参与生长调节和一系列发育过程。郑舒丹等[6]研究表明,存在少量miR-615的靶基因与色素沉着有关,其中色素沉着通路中筛选到TYR03、OCA2、IRF4、PLA2G6基因,对于研究miR-615调控毛色的机制有重要意义。目前对于miR-615的研究大量集中在人类疾病方面,在猪皮肤组织中的研究较少。本研究采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究miR-615在香猪不同颜色皮肤组织中的表达情况,为进一步研究miR-615调控猪皮肤色素沉积的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品

采集贵州大学猪场的健康香猪耳部黑色皮肤组织和背部白色皮肤组织,剪成2 cm×2 cm大小,用锡箔纸包好置于液氮中,带回实验室后置于 -80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol试剂、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒(美国Life Technologies公司)。荧光定量PCR仪(型号:CFX96,美国ABI公司)、PCR扩增仪(型号:GeneAmp9600,美国ABI公司)。

1.3 引物

通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的miRBase检索猪miR-615序列,以miR-615的成熟序列为参考序列(Gene ID:100628344;miRBase:MI0017995),使用miRprimer 2.0 PCR测序引物软件设计miR-615特异引物,并引用5S rRNA[7]基因为内参基因,将设计的引物送北京擎科生物公司合成。引物信息见表1。

表1 qRT-PCR引物信息

1.4 皮肤组织总RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol法分别提取香猪白色和黑色皮肤组织样品的RNA,根据miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211)操作指南反转录合成cDNA。反应体系20 μL:Total RNA 4 μL,2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL,miRNA RT Enzyme Mix2 μL,RNase-Free ddH2O 4 μL。

1.5 qRT-PCR反应

采用miRcute 增强型 miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)进行qRT-PCR反应。反应体系20 μL:2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL,50×ROX Reference Dye 2 μL,Forward Primer 0.4 μL,Reverse Primer 0.4 μL,miRNA第一链 cDNA 1 μL,ddH2O 6.2 μL。每个样品设3个重复。反应程序:95 ℃预变性15 min;94 ℃变性20 s,60 ℃退火 34 s,共40个循环。PCR反应结束后进行熔解曲线分析,分析条件:65 ℃ 5 s,95 ℃ 50 s。

1.6 数据统计

将qRT-PCR的Ct值用Microsoft Excel 2019进行统计,应用 2-△△CT法进行miR-615相对表达量分析。以5S rRNA作为内参基因,以黑色为对照组,采用SPSS17.0软件的单因素方差分析,计算miR-615在香猪黑色和白毛色皮肤组织中的相对表达量。计算公式:△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因),△△Ct=△Ct(实验组)-△Ct(对照组),2-△△Ct=相对表达量。

2 结果与分析

2.1 miR-615的扩增曲线和熔解曲线

由图1可见:miR-615的扩增曲线拐点清晰,斜率较高,说明miR-615的扩增效率高;熔解曲线均为光滑的单峰曲线,且退火温度附近无明显杂峰,表明miR-615的qRT-PCR结果可信,符合实验要求。由图 2 可见:5S rRNA基因曲线整体平行性较好,曲线拐点清楚,基线平而无明显上扬趋势,扩增曲线符合标准的S形增长曲线;熔解曲线均为单峰,没有出现非特异性扩增及引物二聚体,表明引物特异性良好,反应体系适合。

图1 miR-615 qRT-PCR扩增曲线和熔解曲线

图2 5S rRNA qRT-PCR扩增曲线和熔解曲线

2.2 miRNA-615在香猪不同颜色皮肤组织中的表达情况

由图3可见:通过qRT-PCR的CT值分析,miR-615在香猪白色皮肤组织中的相对表达量较高,比黑色皮肤组织中的相对表达量高26倍左右,差异极显著(P<0.01)。

图3 miR-615在香猪黑色和白色皮肤组织中的相对表达量注:**表示差异极显著(P<0.01)。

3 结论

本研究通过 qRT-PCR技术分析香猪不同颜色皮肤组织中miR-615的表达情况,结果表明miR-615在香猪白色皮肤组织中的表达量极显著高于黑色皮肤,推测miR-615可抑制黑色素的生成,与香猪白色皮肤的形成有关。

4 讨论

miRNAs是调控转录后基因表达的重要因子,参与多种重要的生理过程,如发育、代谢和疾病的发生[8]。miRNA参与皮肤、毛囊的发育和表皮稳态的调节,可以介导毛囊循环调节机制。大量研究表明,在人、猪、小鼠、山羊、绵羊的毛发生成周期的不同阶段,皮肤中的miRNA表达发生显著变化[9～12]。miR-615与生物体内许多生理功能息息相关,有研究表明,miRNAs在细胞生长和凋亡、血细胞分化、同源基因调控、胰岛素分泌、脑形态发生、心脏发育及胚胎发育后期过程中发挥重要作用[13]。Chunshu Hao等[14]研究表明,miR-221可抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)表达,通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信号通路,从而减轻心肌细胞(CMs)凋亡。S.Mardente等[15,16]发现在人乳头状癌衍生的长期细胞系中,miR-221在甲状腺乳头状癌apd中过量表达。吴鸿福等[17]研究发现,miR-615可能是创伤性神经中枢神经系统损伤的潜在治疗靶点。对于miR-615在猪皮肤组织中扮演的角色和作用还需要进一步探索研究。