范文强 郭占非 张超 边彩月 高晓 许振丹

［摘要］ 目的 探讨雷公藤甲素（TP）对类风湿关节炎（RA）破骨细胞（OC）分化的影响及其机制。

方法 选取2019年9月—2020年8月到我院进行治疗的RA病人20例，分离RA病人外周血单个核细胞（PBMC），通过核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）诱导培养为OC，分别用不同浓度的TP（浓度为10、20、40 nmol/L）干预OC，记为TP各剂量组，未经过TP干预的OC作为对照组。使用细胞计数试剂盒（CCK－8）法测定细胞增殖，流式细胞术测定细胞凋亡，ELISA法检测相关炎症因子表达，实时荧光定量PCR（qRT－PCR）测定标志性基因和分化相关转录因子表达，蛋白质印迹（Western blot）测定p－IκB蛋白以及分化相关转录因子蛋白表达。

结果 与对照组比较，TP各组RA－OC存活率及炎症因子表达呈剂量效应关系降低（F=95.702～185.246，P<0.01），RA－OC凋亡率升高（F=306.798，P<0.01）；而Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表达下调（F=141.455～266.411，P<0.01），NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表达均降低，p－IκB蛋白表达也相应降低（F=130.683～351.640，P<0.01）。

结论 TP可能通过抑制NF－κB信号通路减轻RA病人OC分化，并抑制细胞增殖和炎症反应，以及诱导OC凋亡。

［关键词］ 关节炎，类风湿；雷公藤甲素；破骨细胞；细胞分化；NF－κB；信号通路

［中图分类号］ R593.22;R284

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0232－05

类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、以滑膜炎为主要表现的系统性疾病，其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症反应。破骨细胞（OC）是骨吸收的主要功能细胞，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用，它起源于血系单核－巨噬细胞系统，是一种特殊的终末分化细胞，它可由其单核前体细胞通过多种方式融合形成巨大的多核细胞。有研究表明，RA病人OC增殖活性增加，OC还能介导骨破坏，是RA关节破坏的主要原因。雷公藤甲素（TP）是雷公藤的主要活性成分之一，它具有抗氧化、抗老年性痴呆症、抗癌等功效。TP还能减缓RA大鼠关节损伤。但是关于TP对类风湿关节炎－破骨细胞（RA－OC）的影响及其机制还不清楚，本实验主要研究TP对RA－OC分化的影响及其潜在的调控通路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人体外周血标本 2019年9月—2020年8月，选取到我院进行治疗的RA病人20例，其中男10例，女10例，平均年龄（55.64±8.31）岁。采集外周静脉血8 mL。 病人到我院之前均未接受过治疗（病情无活动）。RA诊断均符合2010年的ACR/EULAR分类标准，排除了患有严重心血管疾病、肝肾功能障碍、恶性肿瘤及系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等其他免疫疾病的病人。本研究已经获得本院伦理委员会批准（批号：2020－142），所有病人均知情同意。

1.1.2 试剂和药物 DMEM培养液购自美国HyClone公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国BD公司；核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）购自美国Pepro Tech公司；CCK－8试剂盒购自日本Dojindo公司；膜联蛋白V－异硫氰酸荧光素（Annexin V－FITC）和碘化丙啶（PI）试剂盒均购自美国Bio－Rad公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量（qRT－PCR）试剂盒购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂盒、PVDF膜购自瑞士Roche公司。TP购自美国Sigma公司（批号：MKBQ7748V）。

1.2 研究方法

1.2.1 TP试剂的配制 取TP药物1 mg溶解于277.8 μL的DMSO溶液中，配制成10 mmol/L溶液，取其中1 μL配制成10 μmol/L溶液。最终将TP稀释成10、20、40 nmol/L的溶液。

1.2.2 RA－OC培养 采用密度梯度离心法分离RA病人外周血单个核细胞（PBMC），將PBMC接种于培养皿中，密度为2×106 /cm2，孵育3 h。用胰蛋白酶将消化后的贴壁细胞接种于24孔板中，密度为2×105/cm2。用含体积分数0.10胎牛血清及RANKL（100 μg/L）、M－CSF（50 μg/L）的DMEM培养液培养PBMC，每2～3 d换液1次，最终形成RA－OC。采用细胞形态学观察、TRAP染色及骨吸收试验对RA－OC进行鉴定。

1.2.3 实验分组 将RA－OC接种于96孔培养板中，分为对照组（A组）和3个不同浓度TP干预组（B组、C组、D组），每组3例。A组加入相应浓度的DMSO，TP浓度为0 nmol/L；B组、C组、D组分别用不同浓度TP（10、20、40 nmol/L）干预。每组做3个复孔，每个实验重复3次。

1.2.4 CCK8法测定RA－OC存活率 RA－OC细胞以1×107/L密度接种至96孔板，细胞培养24 h，每孔加入10 μL的CCK－8试剂，孵育2 h，终止培养，在490 nm波长下检测细胞吸光度（A）值。细胞存活率（%）=待测样品A490/对照A490×100%。

1.2.5 流式细胞术测定RA－OC凋亡率 RA－OC细胞用预冷的PBS洗涤，重悬于结合缓冲液中，调整密度为1×109/L。取100 μL细胞悬液添加到5 mL的流式管中，分别加入5 μL的Annexin V/FITC和PI，孵育15 min，取400 μL的1×结合缓冲液添加到试管中，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNF－α）和白细胞介素6（IL－6）表达 RA－OC离心后收集细胞上清液，然后按照TNF－α试剂盒和IL－6试剂盒说明书操作步骤检测其表达水平。

1.2.7 qPT－PCR方法测定RA－OC中Trap、Ctsk、CTR、MMP－9、NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA表达  用Trizol提取各组RA－OC总RNA，再将其合成cDNA，最后，按照qRT－PCR试剂盒要求进行扩增反应。以GAPDH为内参照，使用2－△△Ct法计算相对表达量。循环条件：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40个循环。所用引物名称及其序列见表1。

1.2.8 Western blot测定p－IκB蛋白及分化相关转录因子蛋白表达 用RIPA裂解液裂解RA－OC并提取细胞中的总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。SDS－PAGE试剂盒分离细胞蛋白，并转移到PVDF膜上。以质量浓度50 g/L脱脂牛奶封闭膜后，在4 ℃条件下与适当的一抗孵育过夜。然后，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜，滴加ECL化学显色、定影。以β－actin为内参照，利用增强型化学发光检测试剂盒检测目的蛋白灰度值。

1.3 统计学分析

利用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料以±s形式表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK－q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP对RA－OC增殖影响

与A组比较，B组、C组和D组RA－OC的存活率显著降低（F=159.408，P<0.01），并呈浓度依赖性。见表2。

2.2 TP对RA－OC凋亡影响

与A组比较，B组、C组和D组 RA－OC的凋亡率显著升高（F=306.798，P<0.001），并呈浓度依赖性。见表2和图1。

2.3 TP对RA－OC炎症反应相关指标影响

与A组相比较，B组、C组和D组 RA－OC的TNF－α和IL－6表达水平显著降低（F=185.246、95.702， P<0.01），且呈浓度依赖性。见表3。

A：对照组（TP为0 nmol/L）；B：10 nmol/L的TP干预组；C：20 nmol/L的TP干预组；D：40 nmol/L的TP干预组。

与A组细胞比较，B组、C组和D组RA－OC的Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表达明显降低（F=141.455～266.411，P<0.01），并呈浓度依赖性。见表4。

2.5 TP对RA－OC中分化相关转录因子表达影响

与A组细胞比较，B组、C组和D组RA－OC的NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表达明显降低（F=173.559～351.640，P<0.01），呈浓度依赖性。见表5和图2。

2.6 TP对NF－κB信号通路相关蛋白p－IκB表达影响结果表明，A组、B组、C组与D组RA－OC的p－IκB蛋白的相对表达量分别为0.95±0.09、0.76±0.07、0.53±0.05和0.40±0.03。与A组相比较，B组、C组和D组RA－OC的p－IκB蛋白表达明显降低（F=130.683，P<0.01），且呈浓度依赖性。见图3。

3 讨论

RA是一种严重的慢性自身免疫性炎症性疾病，关节炎的病理改变主要有滑膜衬里细胞增生、间质内大量炎性细胞浸润，以及微血管新生及软骨和骨组织破坏等。OC的形成、分化及活化会加重RA对骨破坏的程度，如果出现OC将会出现骨破坏的病变。

雷公藤，又名黄藤，首次记载于《神农本草经》，具有祛风通络、消肿止痛、清热解毒等功效，对炎症和自身性免疫疾病具有显著疗效。RA在中医学中属于“痹症”范畴，在《滇南本草》中已经有雷公藤治疗RA的记载，TP可有效抑制RA发病过程中促炎因子的异常升高及炎症递质的上调。研究结果显示，TP能改善RA大鼠关节肿胀，并减轻大鼠关节组织的炎症反应。TP还能抑制RA炎症反应和骨破坏。本实验研究结果表明，TP处理RA－OC后，细胞存活率及炎症因子TNF－α、IL－6表达水平降低，细胞凋亡率增加，提示TP可明显抑制RA－OC增殖和炎症反应，并促进其凋亡。

OC是体内唯一具有骨吸收功能的细胞，若其功能改变可导致骨质吸收异常。已经有研究结果发现，TP不僅对单独培养的OC分化及骨吸收功能具有抑制作用，并且对Tregs－OC共培养体系中OC的分化及骨吸收功能也有明显的抑制作用。标志性因子抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、组织蛋白酶K（Ctsk）、CTR、MMP－9等是一系列与OC吸收有关的酶。TRAP参与了OC介导的骨转换过程，而Ctsk可以影响OC中TRAP的运输。MMP－9是降解OC外基质、参与骨重建的重要蛋白酶，在增强OC的骨吸收中起重要作用。已经有研究表明，高迁移率族蛋白1诱导的OC中TRAP活性显著升高，而TP可以降低其活性。本实验研究结果也显示，TP处理RA－OC后可以降低Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表达。活化T细胞核因子（NFATc1）在OC中发挥着重要的转录调节作用，c－Fos和c－Jun与NFATc1结合可组成一个转录调节复合体。本实验研究显示，TP可显著降低RA－OC的NFATc1、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表达，提示TP可抑制RA－OC分化。

NF－κB具有介导免疫应答的生理功能，炎症反应的发生与NF－κB信号通路激活有关，NF－κB在炎性因子的诱导等多种细胞生物学过程中发挥重要功能。NF－κB信号通路参与了机体RA的调节机制，药物干预可以抑制该通路的活性，从而达到治愈疾病的目的。有研究表明，TP能通过NF－κB信号通路抑制血管内皮细胞的炎性损伤。NF－κB信号通路激活能抑制RA－OC分化及骨吸收。本实验研究结果显示，TP可降低RA－OC中p－IκB蛋白表达，提示TP可能通过NF－κB信号通路影响RA的发展。

综上所述，TP通过抑制NF－κB信号通路减轻RA－OC分化，抑制细胞增殖和炎症反应，并诱导细胞凋亡，这为治疗RA提供了理论基础。但是，本研究也存在一些局限性，比如没有采用NF－κB的激动剂进行TP作用的复验证，没有建立小鼠模型进行体内实验验证。今后，我们将进行这些研究进一步验证本文的结论。

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