王慧瑾 孙亚如 韦超 高华

［摘要］ 目的 鉴定圆锥角膜（KC）发病过程中的差异表达基因（DEGs），探讨KC潜在发病机制。

方法 分别收集5对KC与正常角膜捐献者的角膜组织，通过mRNA表达谱芯片筛选DEGs；借助KEGG通路富集分析明确其生物学功能；通过RT－qPCR验证候选DEGs的表达水平。

结果 共筛选出1 885个DEGs，其功能与TGF－β信号通路、ErbB信号通路、鞘磷脂信号通路、谷氨酸能突触等有关。RT－qPCR验证显示，丝氨酸/苏氨酸激酶25（STK25）、酰基辅酶A结合结构域蛋白4（ACBD4）、锌指蛋白基因ZBTB38、组织蛋白酶B（CTSB）、3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）、血小板凝血酶敏感蛋白的解聚蛋白样金属蛋白酶6（ADAMTS6）、DLG相关蛋白1（DLGAP1）等候选基因的表达水平与芯片结果一致。

结论 明确了KC差异基因表达谱，为后续KC发病机制的深入研究提供了基础数据。

［关键词］ 圆锥角膜；寡核苷酸序列分析；计算生物学

［中图分类号］ R772.23

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0221－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.005

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

圆锥角膜（KC）是一种常见的退行性角膜疾病，其特征是角膜中央和旁中央区基质变薄，角膜曲率增加，通常伴有不规则散光、高度近视等。全世界范围内，KC的患病率为5‰～25‰，尤其好发于青少年。既往研究表明，遗传和环境因素是决定KC发生和发展的关键要素。系列证据表明，KC的发病机制主要包括胶原纤维排列紊乱、胶原片扩张和增宽、基质层分裂成多束胶原纤维，最终导致基质层变薄。但KC的发病机制在分子层面上尚未完全明确。mRNA表达谱芯片作为一种高通量基因表达分析平台，广泛应用于分子诊断、基因表达谱分析等领域。本研究以KC病人及正常角膜捐献者的角膜组织为研究对象，利用人mRNA表达谱芯片鉴定KC中差异表达基因（DEGs），并结合生物信息学分析初步揭示其生物学功能，为后续KC发病机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

KC样本来自山东第一医科大学附属眼科医院收治的5例角膜移植术病人术后组织，其中男4例，女1例，年龄14～21岁，平均（16.0±2.9）岁；其诊断基于病史以及裂隙灯显微镜和角膜地形图等检查结果。对照样本（CON）为5例健康角膜捐献者的角膜环，男4例，女1例，年龄15～21岁，平均（18.2±2.4）岁。两组样本的性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05）。5对样本用于mRNA表达谱芯片检测。本研究由山东第一医科大学附属眼科医院伦理委员会批准和监督，并根据赫尔辛基宣言的原则进行操作。所有参与者均签署知情同意书。

1.2 总RNA的提取

将收集的角膜样本采用Trizol法提取RNA，按照试剂盒说明书进行操作，并将纯化的RNA保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3 DEGs的鉴定

利用上海康成生物科技公司提供的mRNA表达谱芯片（8×60 K，Arraystar）进行表达谱分析。首先将RNA样品扩增并转录成荧光cDNAs，然后将cDNAs与人mRNA微阵列4.0杂交。清洗和固定后，用安捷伦扫描仪G2505C系统对阵列进行扫描。最后使用GeneSpring GX Version 12.1软件对所获得的原始数据进行分位数归一化和进一步的数据处理，并对KC与CON的数据集进行分层聚类分析与火山图可视化分析。以基因表达差异倍数≥2以及统计学处理结果显示P<0.05作为标准鉴定DEGs。

1.4 KEGG通路富集分析

通过DAVID6.8数据库（https：//david.ncifＧcrf.gov/），以P<0.05、差异倍数≥2为界值，对DEGs进行KEGG通路富集分析。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT－qPCR）验证DEGs

根据试剂盒的说明书，将提取的总RNA反转录成cDNA，进行RT－qPCR检测。以靶基因浓度/GAPDH浓度作为靶基因校正相对水平。候选靶基因的引物名称及其序列见表1。

1.6 统计学分析

使用Graph Pad Prism 7.00软件进行统计学分析。计量资料结果以±s形式表示，组间比较采用t检验。应用Fisher精确检验鉴定KEGG通路富集分析显著富集的途径。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KC组织DEGs的聚类分析以及火山图可视化分析

本文分层聚类分析结果表明，KC组与CON组样本出现明显聚类现象，存在明显的基因富集（图1A）。火山图可视化结果表明，共鉴定出1 885个DEGs，其中1 071个上调基因（6.19%），814个下调基因（4.71%）；15 412个基因无显著变化（89.1%）（图1B）。表明KC角膜组织发生明显的基因表达差异。

2.2 KC组织DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果显示，下调基因主要参与松弛素信号通路、鞘磷脂信号通路、长寿调控通路、谷氨酸能突触等信号通路（图2A）；而上调基因主要富集在TGF－β信号通路、ErbB信号通路、轴突导向、FcγR介导的吞噬等信号通路（图2B）。

2.3 候选DEGs的RT－qPCR水平验证

针对15个候选差异基因进行的RT－qPCR水平验证结果显示，与CON组比较，KC组STK25、ACBD4、CRBN、ZBTB38、CTSB、ABHD16A、SAR1B等基因的表达水平明显增加，差异有统计学意义（t=2.821～8.945，P<0.05）；而HMGCR、ADAMTS6、SRPX2、DLGAP1等基因的表达水平则明显降低，差异有显著统计学意义（t=2.802～7.838，P<0.05）。見表2。

A：DEGs的分層聚类分析图，红色条码代表表达上调基因，蓝色条码代表表达下调基因；B：DEGs的火山图，蓝点代表下调基因，红点代表上调基因。横坐标为表达差异倍数log2（Fold Change），纵坐标为－log10（P value）。

3 讨论

作为一种常见的好发于青春期的扩张性角膜疾病，KC会导致视力严重降低。大量证据表明，遗传与环境因素均在KC的发病中起关键作用，但目前对KC的确切病理机制仍不明确。本研究通过mRNA表达谱芯片数据分析，建立了KC角膜差异基因表达谱，并且这些DEGs在功能上与TGF－β信号通路、ErbB信号通路、鞘磷脂信号通路以及谷氨酸能突触等信号通路有关。这些结果为后续探讨KC的发病机制研究提供了有价值的线索。

研究表明，TGF－β信号通路、鞘磷脂信号通路、Hedgehog信号通路等信号通路失调参与KC的发病。本文通过KEGG通路富集分析发现，TGF－β信号通路以及鞘磷脂信号通路等在KC角膜DEGs中显著富集，进一步表明本研究数据的可靠性。此外，本研究还在KC角膜DEGs中富集到了松弛素信号通路、ErbB信号通路以及FcγR介导的吞噬等尚未报道的信号通路。相关研究显示，松弛素信号通路、Erb信号通路以及FcγR介导的吞噬等信号通路在角膜发育、损伤修复等方面发挥重要的作用。这提示本文新鉴定的信号通路可能在KC发病过程中发挥重要的调节作用，但需实验证据支持。

角膜是神经纤维非常丰富的组织，但神经在KC发病机制中的作用尚不明确。有研究通过共聚焦显微镜研究发现，KC病人的角膜神经在形态上发生明显变化，主要表现为神经纤维变短、基底神经丛缠绕过程增强、基底神经丛密度下降。在功能上，KC病人的角膜神经支配与神经敏感度较正常角膜显著下降。但目前有关KC病人角膜神经的形态与功能改变的分子机制尚不清楚。本研究显示，KC组织部分DEGs在功能上与谷氨酸能突触、神经轴突导向等信号通路密切关联，这在分子层面上支持KC病人的角膜神经功能异常，但需后续实验验证。

相关研究显示，细胞外基质降解、细胞凋亡与自噬等是KC的重要病理机制。作为一种常见的溶酶体半胱氨酸肽酶，CTSB在调控细胞外基质降解、细胞凋亡等方面发挥重要作用。KC组织中CTSB的表达上调提示其可能通过上述机制参与KC的发病过程。HMGCR是胆固醇合成途径的关键限速酶，其表达水平与施尼德结晶状角膜营养不良发生有关，提示其可能通过影响胆固醇合成参与KC的发病过程。另外还有研究结果显示，ABHD16A和SAR1B基因与脂质稳态调节等密切相关。而本文研究结果显示，KC组织中的ABHD16A和SAR1B表达上调，推测上述两种基因可能通过调控脂质代谢途径影响KC的发病过程。此外，ADAMTS可以调节基质降解、生理和病理组织重塑、细胞侵袭和转移，而KC的病理过程与基质降解密切相关，ADAMTS6表达水平上调提示其可能通过调控基质降解过程参与KC的发病。

KABZA等通过转录组研究发现，KC组织中存在异常的TGF－β信号通路。本研究结果显示，TGF－β信号通路在KC组织的上调DEGs中显著富集，并且TGF－β表达水平下降。TGF－β信号是参与调节细胞外基质（ECM）分泌和组装的关键信号通路之一，与纤维化密切相关。而TGF－β主要作用是抗纤维化，并且可以刺激KC基质细胞（HKC）生成正常的ECM，促进正常ECM合成。推测TGF－β信号通路的失调可能与KC组织ECM的改变有关。

综上所述，本文通过人mRNA表达谱芯片检测明确了KC差异基因表达谱，在功能上DEGs与TGF－β信号通路、ErbB信号通路、鞘磷脂信号通路、谷氨酸能突触等有关。本文结果可为后续KC的诊断与机制研究等提供参考。

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（本文编辑 黄建乡）