马晓涵 韩滨 高凡 迟松

［摘要］ 目的 探讨氟西汀对β－淀粉样蛋白25－35（Aβ25－35）诱导的BV2小胶质细胞炎性反应的作用及机制。

方法 应用Aβ25－35刺激BV2细胞模拟阿尔茨海默病（AD）的炎性环境。实验分为空白对照组、Aβ25－35组、Aβ25－35+不同浓度氟西汀组和Aβ25－35+双硫仑组。采用CCK8法检测细胞活力，通过乳酸脱氢酶（LDH）实验、Annexin V－FITC/PI双染色及透射电子显微镜评估细胞焦亡水平。采用Western blot法检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）、活化半胱氨酸蛋白酶－1（cleaved－caspase－1）、膜穿孔蛋白D（GSDMD）等炎性小体及焦亡相关蛋白的表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定促炎因子白细胞介素1β（IL－1β）和白细胞介素18（IL－18）的表达，DCFH－DA荧光染色法检测活性氧（ROS）的水平。

结果

与空白对照组相比，Aβ25－35组的细胞活力降低，NLRP3炎性小体和焦亡相关因子（NLRP3、ASC、caspase－1、cleaved－caspase－1、GSDMD、IL－1β、IL－18）的表达明显增加，LDH释放量及细胞焦亡比例升高，细胞内ROS的生成增多，差异均有显著性（F=2.787～30.457，P＜0.05）；与Aβ25－35组相比，经不同浓度氟西汀预处理的细胞存活率明显增高，促炎因子IL－1β、IL－18表达明显减少，炎性小体及焦亡相关蛋白的表达下调，LDH的释放量和细胞焦亡比例降低，ROS的生成明显减少，其中以高剂量（20 μmol/L）氟西汀的作用最为显著。

结论 氟西汀可抑制Aβ25－35诱导的BV2细胞ROS生成、NLRP3炎性小体活化和细胞焦亡，这为延缓AD进展提供了新的治疗思路。

［关键词］ 氟西汀；小神经胶质细胞；细胞焦亡；NLR家族，热蛋白结构域包含蛋白3；淀粉样β肽类；阿尔茨海默病

［中图分类号］ R338.2；R976

［文献标志码］ A

［KEY WORDS］ fluoxetine; microglia; pyroptosis; NLR family， pyrin domain－containing 3 protein; amyloid beta－peptides; Alzheimer disease

阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知障碍、记忆减退和精神行为症状为主要临床特征的神经退行性疾病，其致残率高，病程较长，目前尚无有效的防治策略。AD的发病机制存在多种假说，其中β－淀粉样蛋白（Aβ）激活小胶质细胞的炎症反应被认为在AD的发病过程中起着关键作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是由NLRP3受体、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）组成的多蛋白复合体，在中枢神经系统中主要表达于小胶质细胞。研究表明，NLRP3 炎性小体可被Aβ激活，进而促进Aβ的沉积和微管蛋白tau 的过度磷酸化。此外，NLRP3 炎性小体的激活能够触发小胶质细胞的焦亡，这是一种新的程序性的细胞死亡形式，表现为细胞不断肿胀直至细胞膜破裂，释放大量炎性递质，加剧神经炎症反应。

氟西汀是一种选择性的5－羟色胺再摄取抑制剂，在临床上广泛应用于抑郁症的治疗。最近的研究发现，氟西汀能够通过抗炎、抗氧化应激发挥神经保护作用。在抑郁动物模型中，氟西汀能通过下调 NLRP3 信号通路抑制小胶质细胞的活化和炎性因子的分泌。尽管研究发现抗抑郁药的长期应用能够降低AD 罹患风险并改善认知能力，但是氟西汀能否抑制AD环境下小胶质细胞焦亡和神经炎症目前尚无报道。本研究使用Aβ25－35刺激 BV2 小胶质细胞模拟AD炎性环境，以NLRP3炎性小体与细胞焦亡为切入点，探讨氟西汀对AD的保护作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

永生系小鼠BV2小胶质细胞购于武汉普诺赛公司。氟西汀购于美国Sigma公司。Aβ25－35、双硫仑和CCK8检测试剂盒购于美国MCE公司；胎牛血清、青鏈霉素混合液以及MEM培养液购自武汉普诺赛公司；BCA蛋白检测试剂盒、Annexin V－FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、白细胞介素1β（IL－1β）及白细胞介素18（IL－18）的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗购自武汉伊莱瑞特公司；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒购自北京索莱宝公司；PBS缓冲液、RIPA裂解液和DCFH－DA活性氧（ROS）检测试剂盒购自上海碧云天公司；ECL试剂盒购于武汉博士德公司；caspase－1抗体购于美国Santa cruz公司；NLRP3、ASC和活化半胱氨酸蛋白酶－1（cleaved－caspase－1）抗体购于美国CST公司；GAPDH和膜穿孔蛋白D（GSDMD）抗体购自美国Proteintech公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 BV2细胞生长于含有体积分数0.10胎牛血清和10 g/L青链霉素的MEM培养液中，置于含体积分数0.05 CO2的37 ℃恒温培养箱内培养24 h后传代。本研究使用第3～5代的细胞。首先将BV2细胞以每孔大约5×103个细胞的密度种植于96孔板中，用不同浓度的Aβ25－35处理12、24、36、48 h，利用CCK8检测细胞活力，获得Aβ25－35最佳处理浓度（20 μmol/L）和时间（24 h）。实验分为以下6组：空白对照组（A组），Aβ25－35组（B组），Aβ25－35+小剂量（5 μmol/L）氟西汀组（C组），Aβ25－35+中剂量（浓度10 μmol/L）氟西汀组（D组），Aβ25－35+高剂量（浓度20 μmol/L）氟西汀组（E组），Aβ25－35+双硫仑（10 μmol/L）组（F组）。除空白对照组外，其他各组用不同浓度的氟西汀或双硫仑预处理BV2细胞2 h，再加入20 μmol/L的Aβ25－35培养24 h用于后续实验。

1.2.2 CCK8法检测细胞活力 将BV2细胞以大约每孔5×103个细胞的密度接种到96孔板中，待其均匀贴壁生长后，用不同浓度的Aβ25－35、氟西汀、双硫仑进行处理。然后在规定的不同时间点每孔加入10 μL CCK8试剂，在37 ℃下孵育2.5 h。最后用酶标仪测量各组细胞在450 nm波长下的吸光度（A）值，细胞存活率=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.2.3 ELISA法检测细胞上清液中IL－1β和IL－18含量 收集处理好的各组细胞上清液，根据ELISA试剂盒说明书的步骤测定IL－1β和IL－18水平。

1.2.4 LDH释放量检测 LDH的释放反映了细胞质膜完整性的丧失，可间接反映细胞焦亡的程度。收集各组细胞上清液，根据LDH试剂盒说明步骤测定LDH的释放量。

1.2.5 Annexin V－FITC/PI染色 早期凋亡细胞被Annexin V标记，而焦亡和中晚期凋亡细胞可被Annexin V和PI同时标记，所以Annexin V/PI双阳性率可作为细胞焦亡比例的间接指标。收集各组细胞后按Annexin V－FITC/PI双染色凋亡检测试剂盒说明步骤处理，上流式细胞仪检测各组细胞Annexin V/PI双阳性率，使用Flowjo分析数据。

1.2.6 ROS生成的检测 按照DCFH－DA试剂盒说明步骤处理各组细胞，使用Image J 6.0分析各组荧光强度（细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，ROS含量与荧光显微镜下测量的DCF荧光强度呈正比）。

1.2.7 Western blot法检测炎性小体及焦亡相关蛋白表达 处理好的各组细胞以冷PBS洗涤3次后用细胞刮刀刮下置于离心管中，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min。细胞裂解物于4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，取上清（即蛋白样品）。使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。各组蛋白样品加入5×上样缓冲液，金属浴100 ℃煮5 min使蛋白变性。煮好的蛋白按照每孔20 μg上样，进行SDS－PAGE电泳并湿转到PVDF膜上，再用体积分数0.05的脱脂牛奶室温封闭1.5 h，分别加入NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、caspase－1（1∶500）、cleaved－caspase－1（1∶1 000）、GSDMD（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）抗体，4 ℃过夜。以TBST溶液洗膜3次，分别加入稀释好的山羊抗兔IgG（1∶5 000）或山羊抗鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1.5 h。以TBST溶液洗膜3次，ECL发光液显影，扫描后用Image J 6.0分析相应条带灰度值，以GAPDH为内参，计算各目标蛋白的相对表达量。

1.2.8 电镜检测 各组处理好的细胞以冷PBS洗涤2次后用细胞刮刀刮下置于离心管中进行离心（1 000 r/min，5 min），弃去上清液，将离心管中的细胞团块置于体积分数0.025的戊二醛固定液（pH 7.3～7.4）中，4 ℃保存，最后用透射电子显微镜观察细胞形态变化。

1.3 统计学分析

所有实验均独立重复至少3次，使用SPSS 26.0軟件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据均以±s表示，Aβ25－35对BV2小胶质细胞活力的影响采用析因设计方差分析和Bonferroni法校正，其他的多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD－t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 氟西汀对Aβ25－35诱导的BV2细胞活力的影响

析因设计的方差分析结果显示，Aβ25－35的作用浓度与作用时间都对细胞存活率存在显著影响，Aβ25－35在10～40 μmol/L浓度范围内处理BV2细胞24 h后，细胞活力均受到明显的抑制，其中应用20 μmol/L Aβ25－35时细胞的存活率接近50%，表明该浓度可对细胞造成有效伤害，因此选择24 h和20 μmol/L作为Aβ25－35的干预时间和干预浓度。见表1。不同浓度氟西汀处理2 h后的细胞活力差异具有统计学意义（F=11.202，P＜0.05），组间两两比较，与空白对照组相比，1～20 μmol/L氟西汀对细胞活力影响不明显（P＞0.05），40和60 μmol/L氟西汀则显著降低了细胞活力（P＜0.05）（图1a），因此后续实验中选择5、10和20 μmol/L作为氟西汀的治疗浓度。空白对照组、Aβ25－35组和不同浓度氟西汀预处理组的细胞活力差异具有统计学意义（F=19.664，P＜0.05），两两比较结果显示，10和20 μmol/L氟西汀预处理细胞2 h逆转了Aβ25－35诱导的细胞活力下降（P＜0.05）（图1b）。

2.2 氟西汀对Aβ25－35诱导的BV2细胞焦亡的影响

Annexin V－FITC/PI染色结果显示，20 μmol/L Aβ25－35显著增加了PI阳性的BV2细胞数量，而不同浓度的氟西汀预处理降低了PI阳性的细胞数量，且呈剂量依赖性（图2a）。PI阳性细胞的定量分析显示，各处理组间焦亡程度差异具有统计学意义

（F=35.938，P＜0.01），两两比较结果显示，高剂量（20 μmol/L）的氟西汀能够显著降低细胞焦亡比例（P＜0.01）， 但中低剂量的氟西汀对Aβ25－35诱导的细胞焦亡抑制不显著（P＞0.05）（图2b）。各处理组间LDH释放量差异也具有统计学意义（F=6.172，P＜0.05），组间两两比较结果显示，10和20 μmol/L氟西汀预处理降低了Aβ25－35诱导的BV2细胞中LDH的释放（P＜0.05）（图2c）。在形态学上，利用透射电镜可观察到20 μmol/L Aβ25－35刺激后的BV2细胞出现肿胀变形、细胞膜完整性破坏及大量焦亡小体（空泡变性）等典型的细胞焦亡特征；与Aβ25－35组相比，20 μmol/L氟西汀处理组细胞焦亡缓解，细胞形态变化不明显（图2d）。以上结果表明，氟西汀的应用，尤其是高剂量（20 μmol/L）氟西汀可以有效抑制Aβ25－35诱导的BV2细胞焦亡。

2.3 氟西汀对BV2细胞中Aβ25－35诱导的GSDMD表达影响

各处理组间GSDMD蛋白的表达差异具有统计学意义（F=4.001，P＜0.05）；与空白对照组相比较，Aβ25－35组细胞中GSDMD的表达显著增加（P＜0.01），而20 μmol/L氟西汀和10 μmol/L 双硫仑（GSDMD特异性拮抗剂）处理后GSDMD蛋白表达均较Aβ25－35组明显降低（P＜0.05）（图3a）。此外，双硫仑对BV2细胞活力影响也具有统计学差异（F=44.778，P＜0.01），其中10 μmol/L双硫仑能够逆转Aβ25－35诱导的BV2细胞活力下降（P＜0.05）和细胞焦亡（图2a、3b～e）。

2.4 氟西汀对BV2细胞中Aβ25－35诱导的NLRP3炎性小体激活的影响

各处理组间的NLRP3（F=2.787，P＜0.05）、ASC（F=5.832，P＜0.05）、caspase－1（F=3.164，P＜0.05）、cleaved－caspase－1（F=3.145，P＜0.05）蛋白表达比较差异均具有统计学意义。两两比较结果显示，与空白对照组相比，Aβ25－35组上述炎性小体相关蛋白的表达均显著上调（P＜0.05），但该上调作用在高剂量（20 μmol/L）氟西汀预处理后均得到了抑制（P＜0.05）。见图4、表2。

2.5 氟西汀对炎性小体相关促炎因子表达影响

各组间IL－1β（F=9.189，P＜0.05）、IL－18（F=6.680，P＜0.05）表达比较差异均有显著性。两两比较结果显示，与空白对照组相比较，Aβ25－35组细胞上清液中IL－1β、IL－18的含量均显著增加（P＜0.01），而不同浓度的氟西汀（5、10、20 μmol/L）和双硫仑（10 μmol/L）则抑制了IL－1β和IL－18的表达（P＜0.05）。见表2。

2.6 氟西汀对Aβ25－35诱导的BV2细胞中ROS产生的影响

各处理组间ROS荧光强度比较差异具有显著性（F=15.159，P＜0.05）。两两比较结果显示，与空白对照组相比，Aβ25－35组ROS荧光强度明显增强（P＜0.01）；而不同浓度的氟西汀均抑制了Aβ25－35诱导的ROS的生成，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；但10 μmol/L双硫仑处理组与Aβ25－35组相比，差异无显著性（P＞0.05）。见图5、表2。

3 讨论

研究发现，氟西汀能够在多种疾病中通过抑制NLRP3炎性小体活化进而减轻神经炎症反应并改善神经功能，如抑郁症、脑损伤和萎缩性黄斑变性。本研究结果证实，Aβ25－35能够诱导BV2细胞NLRP3炎性小体的激活和细胞焦亡，促进炎性细胞因子IL－1β和IL－18的释放，而这些都可以被外源性的氟西汀所抑制，提示氟西汀可能通过抑制NLRP3炎性小体激活、小胶质细胞焦亡以及随后的炎症级联反应对AD发挥神经保护作用。越来越多的证据表明，NLRP3信号通路在AD的发生和发展中发挥着关键作用。关于Aβ如何介导小胶质细胞NLRP3炎性小體激活目前已有多种假说被提出。有研究认为，Aβ作为NLRP3炎性小体的启动或活化刺激物，最终导致由caspase－1介导的炎性因子（IL－1β、IL－18）的释放，而且在特定条件下，活化的caspase－1将裂解下游的成孔蛋白GSDMD，从而促进小胶质细胞发生焦亡。本实验结果表明，氟西汀的应用，尤其是高剂量（20 μmol/L）的氟西汀可以有效缓解Aβ25－35诱导的BV2细胞焦亡，主要表现为LDH释放量降低、PI阳性的BV2细胞数量减少以及细胞形态学上的变化；此外，氟西汀也可以逆转Aβ25－35诱导的细胞活力下降。GSDMD不仅是焦亡的关键因子，也是焦亡成孔的候选蛋白之一。为了明确GSDMD是否在Aβ25－35诱导的细胞焦亡中发挥作用，本研究使用10 μmol/L双硫仑（GSDMD特异性拮抗剂）作为对照，实验结果显示，双硫仑有效抑制了GSDMD的表达和细胞焦亡，初步证实了GSDMD在Aβ25－35诱导的细胞焦亡中发挥关键作用。此外，高剂量（20 μmol/L）的氟西汀可以有效降低Aβ25－35诱导的BV2细胞GSDMD的表达进而改善焦亡。

本团队前期研究显示，氟西汀能够通过抑制NLRP3炎性小体和caspase－1的活化改善蛛网膜下隙出血和抑郁。AMBATI等的研究显示，氟西汀可直接与NLRP3蛋白结合并阻止NLRP3－ASC炎症小体的组装和激活，进而缓解萎缩性黄斑变性。本研究探讨了氟西汀是否可靶向抑制Aβ25－35介导的NLRP3炎性小体激活，结果显示，高剂量（20 μmol/L）氟西汀下调NLRP3炎性小体相关蛋白（NLRP3、ASC、caspase－1、cleaved－caspase－1）的表达，提示氟西汀可能通过抑制NLRP3炎性小体激活对AD产生保护作用。已知IL－1β和IL－18在脑内神经炎症的启动和维持中发挥关键作用。与先前在抑郁模型中的研究结果一致，本研究结果表明，氟西汀的应用能显著抑制Aβ25－35诱导的IL－1β和IL－18产生。

ROS除了作为NLRP3炎性小体的重要上游活化信号外，还与AD的发生发展密切相关。有研究结果表明，氟西汀能在多种情况下减少ROS的生成。本文研究结果显示，与Aβ25－35组相比较，不同浓度的氟西汀预处理显著降低了细胞内ROS含量，且该作用呈剂量依赖性。由此推测，氟西汀可能通过抑制Aβ25－35诱导的ROS生成抑制NLRP3炎性小体的活化。

综上所述，氟西汀能够抑制Aβ25－35诱导的BV2小胶质细胞ROS产生、NLRP3炎性小体激活和细胞焦亡，进而改善神经炎症反应，氟西汀可能通过调节ROS/NLRP3/GSDMD信号通路在AD中发挥神经保护作用，这为延缓AD发展提供了新的治疗思路，值得进一步深入研究。

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（本文編辑 马伟平）