李岩 李成明 张明童 李冬华 马潇

【摘 要】 目的：建立同时测定宣肺止嗽合剂中4种生物碱含量的高效液相色谱分析方法。方法：色谱柱为安捷伦SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙睛-0.1%磷酸溶液（3∶97）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。结果：吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱4种生物碱成分在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r2≥0.9960，平均回收率分别为97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，对应的 RSD 分别为 1.2%、1.2%、1.6%、1.4%（n=9）。10批宣肺止嗽合剂样品中吗啡的含量为0.078～0.160 mg·mL-1、磷酸可待因的含量为0.008～0.025 mg·mL-1、蒂巴因的含量为0.0002～0.0013 mg·mL-1、盐酸罂粟碱的含量为0.010～0.025 mg·mL-1。结论：该方法操作简便，结果准确，可用于宣肺止嗽合剂的质量控制，为其质量标准的提升提供参考依据。

【关键词】 宣肺止嗽合剂；吗啡；磷酸可待因；蒂巴因；盐酸罂粟碱；含量测定；高效液相色谱法

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）01-0043-05

Determination of Four Alkaloids in Xuanfei Zhisuo Mixture

LI Yan1 LI Chengming2 ZHANG Mingtong3* LI Donghua3 MA Xiao3

1. Audit and inspection center of Gansu Drug Administration， Lanzhou 730050， China

Technology Engineering Laboratory， National Medical Products Administration Key Laboratory of

Quality Control of Chinese Medicinal Materials and Decoction Pieces）， Lanzhou 730070， China;

2. Department of Pharmacy， Gansu Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China;

3.Gansu Provincial Institute of Drug Inspection （Gansu Provincial Chinese and Zang Medicine Inspection and Testing

Abstract：Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of four alkaloids in Xuanfei Zhisuo mixture. Methods Chromatographic column： Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;mobile phase： ethylene-0.1% phosphoric acid solution （3∶97）， detection wavelength： 210 nm;Flow rate： 1.0 mL·min-1;column temperature：30 ℃;injection volume：10 μL. Results The linearity of morphine， codeine phosphate， tibaine and papaverine hydrochloride in the range of their respective mass concentrations was good with correlation coefficient r ≥0.9960. The average recoveries were 97.8%， 96.9%， 97.4% and 97.5%， respectively.The corresponding RSD were 1.2%， 1.2%， 1.6%， 1.4% （n=9）.The contents of morphine， codeine phosphate， dibaine and papaverine hydrochloride in 10 batches of Xuanfei Zhishou mixture were 0.078-0.160 mg·mL-1， 0.008-0.025 mg·mL-1， 0.0002-0.0013 mg·mL-1 and 0.010-0.025 mg·mL-1.Conclusion The method is simple and accurate， which can be used for the quality control of Xuanfei Zhisuo mixture and provide reference for the improvement of its quality standard.

Keywords：Xuanfei Zhisuo Mixture; Morphine;Codeine Phosphate;Tibaine;Papaverine Hydrochloride;Content Determination;HPLC

宣肺止嗽合劑收录于2020年版《中国药典》（一部）中，由蜜罂粟壳、荆芥、前胡、桔梗等10味中药组成，具有疏风宣肺、止咳化痰之功，用于治疗风邪犯肺证咳嗽，症见咳嗽、咽痒、鼻塞流涕、恶寒发热、咯痰［1］。该制剂中含有蜜罂粟壳，其主要成分为吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱等多种生物碱成分。吗啡具有镇痛、镇咳和抑制呼吸等药理作用［2-4］，磷酸可待因、蒂巴因和盐酸罂粟碱也具有显著的止咳、镇痛作用［5］，说明罂粟壳是通过多种成分发挥作用。但是，吗啡及其其他生物碱成分连续服用易产生依赖性、瘾癖，超剂量使用会出现呃逆、呼吸困难、昏迷等中毒症状。因此，为了确保制剂的安全性及有效性，需要确定可供质量控制的特征成分，制定质量控制标准。2020年版《中国药典》（一部）对宣肺止嗽合剂含量测定项中，采用高效液相色谱（HPLC）法控制蜜罂粟壳中的吗啡含量，且前处理过程繁琐、费时，并易造成样品中生物碱的损失，同时由于样品中吗啡含量较低，其他成分对其影响较大。因此，本实验采用HPLC法同时测定宣肺止嗽合剂中4种生物碱（吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱）含量，以完善、提升宣肺止嗽合剂的质量控制标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ME24-102型万分之一电子天平、XS205DU十万分之一型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料 吗啡对照品（批号：171201-201324，含量≥93.9%）、磷酸可待因（批号：171203-200303，含量≥96.9%）、蒂巴因（批号：171216-200403，含量100.0%）、盐酸罂粟碱（批号：171214-200404，含量≥99.9%）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。宣肺止嗽合剂10批（甘肃普安制药有限公司提供）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取吗啡0.01130 g、磷酸可待因0.01047 g，蒂巴因0.01660 g、盐酸罂粟碱0.01088 g，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇超声使其溶解，并定容至刻度，摇匀，制成对照品储备液。再各取适量置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得含吗啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、蒂巴因0.3220 μg·mL-1、盐酸罂粟碱0.5217 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 精密量取宣肺止嗽合剂样品1 mL，用氨试液10 mL调节pH值至10～11，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加流动相适量使溶解，转移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，摇匀，即得。同时制得空白对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：安捷伦SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙睛-0.1%磷酸溶液（3∶97）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。色谱图如图1所示。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取对照品储备液适量，加甲醇溶液配制成吗啡含量为0.849 μg·mL-1、1.698 μg·mL-1、3.395 μg·mL-1、8.489 μg·mL-1、16.977 μg·mL-1、84.886 μg·mL-1，磷酸可待因含量为0.203 μg·mL-1、0.406 μg·mL-1、0.812 μg·mL-1、2.029 μg·mL-1、4.059 μg·mL-1、20.293  μg·mL-1，蒂巴因含量为0.033 μg·mL-1、0.066 μg·mL-1、0.133 μg·mL-1、0.332 μg·mL-1、0.664 μg·mL-1、3.320 μg·mL-1，盐酸罂粟碱含量为0.052 μg·mL-1、0.104 μg·mL-1、0.209 μg·mL-1、0.522 μg·mL-1、1.043 μg·mL-1、5.217 μg·mL-16个梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件分析，分别进样10 μL。按外标两点法，以峰面积为横坐标，进样量（μg·mL-1）为纵坐标，得出4种成分的回归方程、相关系数r2及线性范围，结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。见表1。

2.3.2 精密度试验 精密吸取浓度为吗啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、帝巴因0.3320 μg·mL-1、盐酸罂粟碱0.5217 μg·mL-1混合对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，测得峰面积积分值的RSD在0.22%～0.45%，表明仪器精密度良好。见表2。

2.3.3 重复性试验 取编号1的供试品溶液，按照“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，“2.2”项下色谱条件分析测定，分別测定并计算各成分的含量。测定结果RSD在1.35%～2.11%，表明方法重复性良好。见表2。

2.3.4 稳定性考试验 取编号1的供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h进样10 μL进行测定，测得各成分的含量RSD在0.56%～0.65%，表明供试品溶液在24 h内稳定。见表2。

2.3.5 加样回收率试验 采用加样回收法，取已知4种生物碱含量的宣肺止嗽合剂（编号1）样品9份，分3组，取样量各为1 mL，精密加入低、中、高（0.5倍、1倍、1.5倍）3个浓度的混合对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进行测定，计算回收率。详见表3。吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱的平均加样回收率分别为97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，RSD分别为1.2%、1.2%、1.6%、1.4%。

2.4 样品的测定 取10批次宣肺止嗽合剂，分别精密量取2 mL，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件进行测定，按外标法计算样品中吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱的含量。结果见表4。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备条件的优化 本方法采用加浓氨试液，在碱性条件下将生物碱盐转变成游离生物碱，用水饱和的正丁醇提取，去除脂溶性杂质，再用含5%磷酸的20%甲醇溶液提取。为了优化提取的条件，以A（供试品溶液取样量）、B（氨试液使用量）和C（水饱和正丁醇提取量）为3个因素，设计L9（34）正交试验。各因素的3水平分别为：A（1 mL、2 mL、3 mL）;B（5 mL、10 mL、15 mL）;C（15 mL、25 mL、35 mL）。样品液的制备：精密量取宣肺止嗽合剂样品A取样量，用氨试液提取量B调节 pH 值至10～11，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次使用量C，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加流动相适量使溶解，转移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，摇匀，即得。经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，弃去初滤液，取续滤液进行测定分析。极差（R）结果表明，3个因素中样品量对提取率影响最大，其次是氨试液提取量，影响最小的是样品水饱和正丁醇提取量。试验表明，以宣肺止咳合剂取样量为1 mL，加入氨试液10 mL后用25 mL水饱和正丁醇提取量条件最佳，提取率最高，故确定为供试品制备方法 。

3.2 测定波长的选择 通过DAD检测器进行全波长扫描（200～400 nm），考察了4个组分的最大紫外吸收波长，结果发现吗啡、磷酸可待因、蒂巴因都在210 nm波长处有最大吸收、盐酸罂粟碱250 nm波长处具有最大吸收，考虑可待因与蒂巴因含量较低，为获得更大灵敏度，最终确定210 nm作为检测波长，四种生物碱均有良好的响应，灵敏度较高。

3.3 流动相的优化 中国药典选用0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-0.005 moL/L庚烷磺酸钠溶液-乙腈（5∶5∶2）作为流动相，考虑到庚烷磺酸钠对色谱系统污染较大，并且样品对色谱柱的要求较高。因此通过优化方法降低了对色谱系统的污染。经查阅相关文献资料［6-10］，本实验主要考察了甲醇-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸的0.01 moL·L-1磷酸二氢钾缓冲液、乙腈-0.1%甲酸的0.02 mol·L-1乙酸铵溶液4种流动相，结果表明，乙睛-0.1%磷酸溶液样品中，虽然吗啡和盐酸罂粟碱的色谱峰出峰时间较为接近，但各色谱峰的分离度均大于1.5，且各色谱峰的峰形较好，故以此流动相比例进行测定，后续实验将进一步对流动相进行优化。

3.4 结果分析 10批宣肺止嗽合剂测定结果显示，吗啡的含量为0.078～0.160 mg·mL-1、磷酸可待因的含量为0.008～0.025 mg·mL-1、蒂巴因的含量为0.0002～0.0013 mg·mL-1、盐酸罂粟碱的含量为0.010～0.025 mg·mL-1，且4种成分间存在一定的变化趋势：即吗啡含量高，其他3个成分的含量也随之增加；可见《中国药典》以吗啡的含量測定对宣肺止嗽合剂质量进行控制，具有一定的意义，但不够用全面。本研究建立了高效液相色谱同时测定宣肺止嗽合剂中4种成分的含量测定方法，具有前处理简单，灵敏度高的特点，为较为全面的控制宣肺止嗽合剂质量，提供了数据支持，同时对修订完善其质量标准，保证药品有效性和安全性提供了实验基础。

参考文献

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（收稿日期：2022-05-09 编辑：陶希睿）