曹玉 史达 陈洁 张玲

【摘 要】

目的：應用电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）建立同时测定活血止痛制剂（胶囊、片剂、软胶囊）中30种无机元素的方法，并合理评价。方法：样品采用程序升温微波消解处理（胶囊剂47批，片剂29批，软胶囊7批），通过在线内标法以元素72锗（Ge）、115铟（In）、209铋（Bi）为内标，电感耦合等离子体质谱法测定。结果：钠（Na）、镁（Mg）、钾（K）、钙（Ca）、铝（Al）元素检测质量浓度线性范围为0.2～20 μg/mL，汞（Hg）元素检测质量浓度线性范围为0.2～10 ng/mL，铁（Fe）元素检测质量浓度线性范围为0.8～80 μg/mL，镉（Cd）、铅（Pb）、砷（As）、钴（Co）、钒（V）、镍（Ni）、铊（Tl）、金（Au）、钯（Pd）、铱（Ir）、锇（Os）、铑（Rh）、钌（Ru）、硒（Se）、银（Ag）、铂（Pt）、锂（Li）、锑（Sb）、钡（Ba）、钼（Mo）、铜（Cu）、锡（Sn）、铬（Cr）元素检测质量浓度线性范围为0.5～300 ng/mL（r均大于0.998）。回收率为88.3%～120.4%，RSD为0.9%～5.9%。制剂中Ca、Na、K、Fe等人体有益元素显著高于其他无机元素，另参照现行药典标准中活血止痛胶囊Pb、As、Hg重金属限度综合评价，其胶囊剂和软胶囊中Pb、As、Hg元素残留量符合相关限度要求，6批片剂中Pb超出以上限度，存在一定用药安全隐患。结论：该方法操作简便、灵敏、准确，可用于活血止痛制剂中多元素检测，为元素风险监控及质量评价提供技术参考。

【关键词】

活血止痛；电感耦合等离子体质谱法；微波消解；重金属；无机元素

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）04-0027-08

Analysis of 30 Heavy Metals and Inorganic Elements in Huoxue Zhitong Soft Capsules，Tablets and

Capsules Based on Microwave Digestion ICP-MS

CAO Yu1 SHI Da1 CHEN Jie1，2 ZHANG Ling1，2*

1.Nanjing Institute of Food and Drug Control， Nanjing 210000，China；2. Nanjing Medical University， Nanjing 211166，China

Abstract：

Objective  To establish a method for simultaneous determination of 30 elements in Huoxue Zhitong preparations （capsules， tablets and soft capsules） by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）. Methods  Samples （47 batches of capsules， 29 batches of tablets， 7 batches of soft capsules） were treated with temperature programmed microwave digestion. Germanium， indium and bismuth were used as internal standards by on-line internal standard method and determined by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）. Results  The linear range of detection concentration of Na， Mg， K， Ca and Al was 0.2-20 μg/mL. The linear range of Hg was 0.2-10 ng/mL， and the linear range of Fe was 0.8-80 μg/mL. The linear range of Cd， Pb， As， Co， V， Ni， Tl， Au， Pd， Ir， Os， Rh， Ru， Se， Ag， Pt， Li， Sb， Ba， Mo， Cu， Sn and Cr was 0.5-300 ng/mL （all r>0.998）. The recoveries of elements were between 88.3% and 120.4% with RSD 0.9% to 5.9%. Ca， Na， K， Fe and other beneficial elements in the preparation were significantly higher than those of other inorganic elements. According to the comprehensive evaluation of heavy metal limits of Pb， As and Hg in Huoxue Zhitong capsules in current Pharmacopoeia standards， the residues of Pb， As and Hg in capsules and soft capsules met the relevant limits， but Pb in 6 batches of tablets exceeded the above limits， so there was some hidden danger in drug use. Conclusion the method is simple， sensitive and accurate， can be used for the determination of multi-elements in Huoxue Zhitong preparation， and provides technical reference for element risk monitoring and quality evaluation.

Keywords：

Huoxue Zhitong ; ICP-MS; Heavy Metals; Elements

活血止痛胶囊、活血止痛片、活血止痛软胶囊均由当归、三七、乳香（制）、冰片、土鳖虫、煅自然铜6味药组成，具有活血散瘀、消肿止痛的功效，用于跌打损伤、瘀血肿痛［1］，临床多用于治疗急、慢性软组织损伤类疾病。制剂中自然铜为矿物药，存在伴生的重金属及有害元素残留风险，其中Pb、Hg、As、Cd、Cu是普遍存在的毒重金属，研究［2-4］表明Pb在人体内的清除速率较慢，长期低剂量接触对人体肝、肾、骨骼、神经系统都会产生危害。目前自然铜的执行标准《中华人民共和国药典》2020年版（以下简称《中国药典》2020版）一部未对重金属进行控制，活血止痛制剂中仅胶囊剂《中国药典》2020年版执行标准收载了Pb、As、Hg三种重金属及有害元素限度控制。活血止痛片执行标准（国家食品药品监督管理局国家药品标准YBZ01112005-2009Z、YBZ25062005-2010Z、YBZ25142005-2009Z、YBZ30222005-2009Z等）及软胶囊《中国药典》2020年版执行标准均未对上述重金属元素进行控制。

本研究参照《中国药典》2020年版、美国药典15种重金属元素限度［5-6］、《ICH Q3D元素杂质指导原则》［7］中原料辅料元素相关限度规定，通过电感耦合等离子体质谱法对活血止痛制剂的Pb、Hg、As、Cd、Cu等毒重金属检验，对比国际相关无机元素限度标准，深入研究其涵盖的无机元素含量［8］，同时对制剂中存在的多种人体有益无机元素分析，进一步明确活血止痛口服制剂质量安全及药效量化元素基础，为合理评价含自然铜矿物药活血止痛口服制剂质量提供参考价值。

1 仪器与试剂

Agilent 7900 ICP-MS仪；CPA225D 十万分之一电子天平 （Sartorius 公司），Milli-Q 纯水仪（默克公司）；MARS 6型微波消解仪（美国CEM公司）；聚四氟乙烯微波消解管（CEM）。

多元素标准混合溶液［Ag、Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Se、Sr、Tl、V、Zn，质量浓度：100μg/mL；唯一标识：21D60453］；［Au、Hf、Ir、Pd、Rh、Ru、Sb、Sn、Te，质量浓度：100μg/mL；唯一标识：21D60005］；单元素标准混合溶液［Mg，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：206034-5；Na，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：1906024-7；Os，质量浓度：100μg/mL；唯一标识：21D4200；K，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：206033-4；Hg，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：20A038-7；Pb，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：20C002-6；Ca，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：203049-8；Ni，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：21D50216；Fe，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：214038-6；Cu，质量浓度：1000μg/mL；唯一标识：20C013-3］;内标标准混合溶液［Bi、Ge、In，质量浓度：10.0μg/mL；唯一标识：21D81077］。以上均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心。硝酸（优级纯，Fisher Chemical），水为超纯水（Milli-Q制备）。

活血止痛胶囊47批，活血止痛软胶囊7批，活血止痛片29批，均为市售。来源为南京中山制药有限公司、湖北惠海希康制药有限公司、江苏万高药业股份有限公司等8家生产企业。

2 方法与结果

2.1 仪器条件 射频功率：1550W；采集模式：质谱图；峰形：3点；重复次数3次，扫描/重复时间100次；稳定时间：10s；分辨率：标准；蠕动泵转速：0.3r/s；样品引入时间：20s；稳定时间：20s；采样深度：8.0mm；雾化气：1.09L/min；雾化室温度：2℃；氦气流量：4.5mL/min。

2.2 微波消解条件 采用程序升温，在600W下，5min内升温至120℃，维持5min；相同功率下，4min钟内再次升温至160℃，维持5min；3min内升温至180℃，维持30min；待程序结束后，冷却至60℃以下，取出消解罐。

2.3 溶液的制备

2.3.1 标准储备液 精密吸取两种多元素标准混合溶液（100μg/mL）及Os单元素标准溶液（100μg/mL）、Ni单元素标准混合溶液（1000μg/mL）、Pb单元素标准混合溶液（1000μg/mL）適量，加2%硝酸至50mL量瓶中，制得10μg/mL储备液；精密吸取K、Ca、Na、Mg、Al各单元素标准溶液1mL至50mL量瓶中，制得200μg/mL储备液；精密吸取Hg单元素标准溶液（1000μg/mL）、Fe单元素标准溶液（1000μg/mL）适量，2%硝酸稀释分别制得100ng/mL、160μg/mL标准储备液。

2.3.2 系列混合标准溶液 分别精密吸取上述单元素、多元素标准储备液适量，加2%硝酸分别制成含K、Ca、Na、Mg、Al 0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，含Fe 0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL，含Hg 0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，含其他元素0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL的系列混合标准溶液，临用新制。

2.3.3 混合内标溶液 精密吸取Ge、In 、Bi标准混合溶液适量，加入2%硝酸制成Ge、In 、Bi混合标准溶液100ng/mL，临用新制，Ge、In 、Bi不同内标矫正代表性ICP-MS线性图如图1、图2、图3所示。

2.3.4 供试品溶液的制备 精密称取活血止痛样品约0.5 g，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入硝酸8 mL，加盖，于室温下预消解过夜，置于微波消解仪中按照“2.2”项下方法消解，待消解完全并冷却至60 ℃以下后取出，缓慢拧开消解罐，将微波消解罐置于赶酸仪中，加热至红棕色气体挥尽，放至室温，转入50 mL量瓶中，少量水洗涤消化罐5次，合并洗涤液至量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，静置，另精密吸取0.5 mL上清液，2%硝酸溶液稀释至10 mL量瓶刻度。若供试品元素浓度不在线性范围内调整稀释倍数进样分析，同法制备试剂空白溶液。

2.4 测定方法 采用在线内标法，以蠕动泵将样品与混合内标溶液混合后，按“2.1”项下条件进样测定，记录响应值分别对系列混合标准溶液及供试品溶液、空白溶液分析，以内标校正的标准曲线法计算各元素的含量。

2.5 线性关系考察 取“2.3.2”项下系列混合标准溶液，按“2.1”项下条件进样测定，保持内标管在仪器工作状态中始终插入混合内标溶液，依次将样品管引入系列混合标准溶液中，记录响应值。以各待测元素质量浓度为横坐标（X）、各待测元素与内标响应值的比值为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线。各单元素标准溶液线性关系见表1。

2.6 检测限和定量限考察 在同等试验条件下，重复测定2%硝酸溶液11次，以测定结果标准偏差（SD）的3.3倍除以各元素标准曲线的斜率，所得结果即为各元素的检测限，以测定结果标准偏差（SD）的10倍除以各元素标准曲线的斜率，所得结果即为各元素的定量限。见表1。

2.7 精密度试验 取“2.3.2”项下各混合标准溶液及单元素标准溶液，按“2.1”项下方法平行测定6次，记录响应值。结果Hg元素响应值RSD为3.5%，其余各元素响应值RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 精密称取同一样品（批号：200405）6份，按照“2.3.4”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下方法测定，由内标校正的标准曲线计算样品中各元素的含量及RSD。由于部分元素（Ru、Rh 、Pd 、Ag、 Sn、 Sb、 Te 、Os、 Ir 、Pt）浓度低于检测限，因此元素重复性以回收率RSD值表示。结果见表2。

2.9 稳定性试验 取加样回收样品（批号：200606），在8 h内等时间间隔连续测定10次，以各元素测定值计算RSD， Hg元素RSD为5.4%，其余各元素的RSD%均小于3.0%，提示供试品制备后应及时检测，减小不稳定元素测定偏差。

2.10 加样回收率试验 取供试品制备项下一半量已知元素含量活血止痛胶囊（批号：190605）、片剂（批号：200405）、软胶囊（批号：200606），精密称定，各6份，置微波消解罐中，精密加入Fe单元素标准溶液（1000μg/mL） 0.4 mL，Hg单元素标准溶液（1μg/mL）0.6 mL，K、Ca、Na、Mg、Al混合标准储备液（20μg/mL）2 mL，多元素混合标准储备液（10μg/mL）0.5 mL，按“2.3.4”项下方法处理，定容至50 mL，稀释后依法测定记录响应值并计算回收率。结果见表2。

2.11 样品含量测定 按照拟定方法，测定活血止痛胶囊47批，活血止痛软胶囊7批，活血止痛片29批次中30种元素的残留量。拟定限度参考《中国药典》2020版、USP 41-NF 36和ICH Q3D相关标准。每批次样品平行双样。结果见表3。

3 讨论

3.1 无机元素研究基础概述 據已有研究［9］报道，无机元素常见分析手段包括紫外-可见分光光度法（UV）、原子荧光光谱法（AFS）［10］、原子吸收光谱法（AAS）［11］、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）［12-13］、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）［14］等。与以上分析技术比较，ICP-MS具有线性范围宽、灵敏度高、干扰少、多种重金属元素同时分析等优点，更适合中药复方制剂中无机元素的检测，本实验在此基础上研究分析该制剂多种重金属及有害元素，为合理评价含矿物药自然铜中成药活血止痛制剂质量提供参考价值。

3.2 待测元素的选择及样品预处理 《中国药典》2020年版四部通则“9302 中药有害残留物限量制定指导原则”明确指出重金属及有害元素为Pb、Hg、As、Cd、Cu等；美国药典列出15种重金属控制元素限度，《ICH Q3D元素杂质指导原则》对元素杂质分类：将Cd、Pb、As、Hg列为第一类元素，将Co、V、Ni、Tl、Au、Pd、Ir、Os、Rh、Ru、Se、Ag、Pt列为第二类元素，将Li、Sb、Ba、Mo、Cu、Sn、Cr列为第三类元素进行限度控制，因此拟定对以上涵盖24种重金属及K、Ca、Na、Mg、Al、Fe等高含量无机元素检测分析。

与微波消解比较，传统的干法灰化和湿法消解存在消解不完全、挥发元素易损失问题，影响结果的精密度与准确度。因此实验中采用高温高压密闭微波消解法预处理样品，经赶酸后得到澄清透明液体，使消解完全。赶酸时由于As、Hg等挥发性元素的存在，因此控制赶酸温度在110 ℃，温度不宜过高。另制剂中含有矿物药自然铜重金属含量异常高，制备供试品溶液时选择适当稀释倍数稀释进样以避免仪器的污染。

3.3 元素含量分析 根据《中国药典》2020年版对活血止痛胶囊Pb、Hg、As的限度规定，明确其中Pb≤60 mg/kg、Hg≤12 mg/kg、As≤300 mg/kg。47批胶囊剂Pb、Hg、As均符合药典限度；照《中国药典》2020年版该胶囊剂重金属限度要求，软胶囊Pb、Hg、As符合以上限度；而29批次片剂中6批次Pb超出以上限度，Hg、As含量符合药典限度。

現行国家药典标准，对元素Cd、Cu等未规定其含量限度，制剂中Cd元素含量较低，最高浓度小于4 μg/g，但其中Cu元素普遍含量较高，其中39批次胶囊剂、6批次片剂其Cu元素均高于美国药典口服浓度限度100 μg/g；砷（As）、钴（Co）、钒（V）、镍（Ni）、铊（Tl）、钡（Ba）、钼（Mo）等元素一定程度超出《ICH Q3D元素杂质指导原则》元素限度。以上中药有害残留物限量指导原则控制的Pb、Hg、As、Cd、Cu 有害元素中，发现活血止痛片剂存在重金属Pb超出胶囊剂药典限度标准及部分制剂Cu元素远高于国际相关标准现象，提示该制剂中存在重金属超限及用药风险隐患。

除Pb、Hg、As、Cd、Cu有害重金属外，制剂中其他人体所需元素Fe、K、Mg、Ca等含量显著高于其他无机元素， 已明确其在参与骨骼代谢、治疗跌打损伤中发挥着显著作用［15-16］。其中Fe元素主要来源于煅自然铜，是合成血红蛋白、肌红蛋白、铁蛋白的必需原料，Cu元素以金属酶形式存在于酶活性部位，提高赖氨酰氧化酶活性，Mg在提高碱性磷酸酶（ALP）活性促进骨细胞增殖发挥着重要作用［17-19］，共同为活血止痛制剂发挥活血散瘀功效提供疗效基础。

以上研究表明，活血止痛制剂中存在活血止痛片重金属含量限度标准缺失，同时片剂中重金属Pb含量高于药典胶囊剂拟定限度，部分重金属超出国际标准现象。而中药制剂组成复杂，不能单一参考国外标准评价制剂质量，如Cu元素既是骨骼生长必需元素同时又存在重金属蓄积的风险，ICH Q3D或美国药典元素限度并不适合中药制剂，因此建立中药材与中药制剂元素范围较广的元素限量标准具有十分重要的研究意义。

本研究采用微波消解ICP-MS法建立同时测定活血止痛制剂中30种元素方法，同时对比《中国药典》2020年版，USP 41-NF 36和《ICH Q3D元素杂质指导原则》国际相关限度标准，为活血止痛质量研究，对拟定合理元素限度保证此类中药口服制剂安全性、有效性提供数据支撑及技术参考价值。

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（收稿日期：2022-06-13 编辑：陶希睿）