王雯慧王 位季 佳李 玙苗 睿张玉平李晓颖宋天扬李素华何承忠

（1. 西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650233；2. 中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650500）

黑颈鹤（Grus nigricollis）与灰鹤（Grus grus）均为鹤形目（Gruiformes），鹤科 （Gruide），鹤属（Grus）的大型涉禽[1-2]。当前，黑颈鹤在全球范围内仅有1 万余只，被世界自然保护联盟（IUCN）列为近危物种，是我国国家Ⅰ级重点保护野生动物[1]。灰鹤全球数量超70 万只，被IUCN 列为无危物种，是我国国家Ⅱ级重点保护动物，也是我国鹤类中种群数量最大的种类[3]。

当羽毛微观结构被作为鸟类物种识别鉴定的参考标准后，国内外研究者对于羽毛显微结构做了大量研究[4]。国内对于鸟类羽毛显微结构的研究自20 世纪90 年代后开始，如通过羽毛微观结构对莺亚科，雨燕科、佛法僧目等鸟类进行了分类鉴定[5-7]。近年来，鸟类羽毛宏观结构指标的研究也见诸报道，如对猛禽覆羽形态特征量化的判别分析[8]。除了对鸟羽进行分类外，也有研究者认为对羽毛结构的量化分析可用于仿生学的研究[9]，但目前对鹤属鸟类羽毛特征结构的研究甚少[10-11] 。

近年来，野生鸟类的盗猎案件时有发生，鹤属鸟类也是盗猎者的捕杀对象。在野鸟的偷猎类刑事案件中，现场难以寻到完整的鸟类尸体，可供追查的线索中常见残留的羽毛[12]。

本研究拟对鹤属鸟类黑颈鹤和灰鹤的飞羽，次级飞羽，尾羽及绒羽的宏观形态及微观结构特征进行研究，对特征指标进行量化分析，寻求鹤属鸟类羽毛结构的差异，以期积累鹤属鸟类生理学基础数据；同时使用羽毛样本的特征指标的量化数据建立Fisher 判别式，为今后仅存羽毛的前提下鹤属鸟类分类鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

选取黑颈鹤与灰鹤成鸟标本各3 只（其中黑颈鹤雌性1 只，雄性2 只；灰鹤雌性2 只，雄性1 只），皆由西南林业大学标本馆收集自云南省内黑颈鹤自然保护区。取每具鹤类标本初级飞羽（第2～4 枚），次级飞羽（第1～3 枚），尾羽（自外侧向内侧第2、4、6 枚），另随机取胸、腹、尾、腰、背、翼部形态完整的绒羽各10 枚。

1.1.2 主要试剂和仪器

所用的乙醇（95%，AR）、无水乙醇（AR）均购自四川西陇化工有限公司；数字病理切片扫描仪（KF-PRO 机型），购自宁波江丰生物信息技术有限公司；数码相机（EOS700D），购自佳能公司；体式显微镜（SZX10 型），购自奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 羽毛外观形态观察及几何形态分析

取初级飞羽、次级飞羽和尾羽，将完整羽毛样本用少许自来水浸泡清洗后，展平，自然阴干，置于纯色背景卡纸，放置比例尺，使用佳能数码相机垂直近距离拍摄，观察羽毛的颜色、形态、色斑等宏观外形特征，并使用ImageJ 软件对图片进行处理，设置好比例尺并在Result 中勾选好需要获得的参数。使用Threshold，ROI Manger功能测算羽片面积，羽片羽轴长，获得每组羽毛每个指标各9 个数值，另计算羽片中段的内翈羽枝长，内翈羽枝与羽干的夹角，每组羽毛每个指标各取30 个值[12]。

1.2.2 羽小枝显微结构观察及分析

取各羽毛中段羽片，置于95% 乙醇中清洗1 h 后，无水乙醇中脱水1～2 min，自然阴干。在体视显微镜下，用眼科剪剪取羽片的一根羽枝，置于防脱载玻片上展平，用刻刀分离羽枝中段两侧的羽小枝，封片固定。绒羽的处理方法为取完整的羽枝，展平于防脱载玻片上，封片固定[13]。通过数字病理切片扫描仪扫描羽小枝切片，随机取10 个视野，统计视野内有钩羽小枝腹齿数，羽小钩数，纤毛对数，无钩羽小枝的腹齿数，每个指标各取30 组数据，利用K-Viewer 软件测算视野内所有羽小节间距及节直径[14-15]。

1.2.3 数据的统计分析

计算各特征的平均值，特征分析数据以“平均值 ± 标准误”表示，若只涉及同一指标在2 个组别中的差异的比较选用独立样本t检验，2 个组别以上的差异比较使用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

形态结构具有显著性差异的指标通过Fisher 判别分析，建立判别函数。使用Python 的numpy工具包进行有放回的随机抽样，每个指标抽样100 次，在SPSS 中建立Fisher 判别函数，统计各函数的方差贡献率及累计贡献率，通过Wilks 的Lambda 的检验对判别函数进行显著性检验，P＜0.05 表示判别能力显著。利用回代估计法验证判别函数的准确性。

2 结果与分析

2.1 羽毛宏观形态结构特征

如图1 所示，2 种鹤类的飞羽，次级飞羽，尾羽均无任何斑纹分布且以渐变纯色为主。灰鹤（图1a）与黑颈鹤（图1d）初级飞羽的大部分面积均为纯黑坚实的长羽片，靠近羽干基部有少量白色羽枝。灰鹤（图1b）和黑颈鹤（图1e）的次级飞羽颜色均呈现出从梢部至基部由深色渐变为浅色的特征，其中灰鹤次级飞羽的梢部深色部分为灰色，黑颈鹤次级飞羽的深色部分为棕黑色，黑颈鹤（图1f）的尾羽梢部颜色为黑色，松散部分呈灰色；灰鹤（图1c）的尾羽羽片梢部呈灰褐色，靠近羽根的部分呈灰白色松散状，灰鹤次级飞羽、尾羽比黑颈鹤次级飞羽、尾羽颜色更浅，且较黑颈鹤存在更多的松散羽枝。

图 1 黑颈鹤和灰鹤的羽毛形态结构特征Fig. 1 The morphological characteristic of feather from G. nigricollisand G. grus

2.2 羽毛宏观形态特征分析

对灰鹤和黑颈鹤的羽毛宏观形态进行分析，结果如表1 所示。黑颈鹤与灰鹤的内翈羽枝长均呈次级飞羽、尾羽、初级飞羽依次减小的特征（P＜0.05），而羽片面积以及羽片羽轴长均呈飞羽大于尾羽的特征（P＜0.05），内翈羽枝与羽干夹角皆为初级飞羽最小的特征（P＜0.05）。2 种鹤类的飞羽内翈羽枝长，尾羽内翈羽枝与羽干的夹角，初级飞羽羽片面积的数据存在明显的差异（P＜0.05）。

表 1 黑颈鹤和灰鹤羽毛结构的宏观指标分析Table 1 The statistics on macro index of the feathers fromG. nigricollisand G. grus

2.3 羽小枝的微观结构特征

黑颈鹤和灰鹤初级飞羽、次级飞羽和尾羽微观结构如图2、图3 所示，2 种鹤类正羽主要由有钩羽小枝和无钩羽小枝构成，且两种羽小枝的微观结构在种间具有相似性。黑颈鹤和灰鹤的有钩羽小枝基部结构为基柄，着生有腹齿，梢部结构为羽脉，着生纤毛和羽小钩；二者次级飞羽的有钩羽小枝可见背纤毛结构短粗，腹纤毛细长，羽脉梢部纤毛结构逐渐退化（见图2b、e）；尾羽有钩羽小枝较飞羽的有钩羽小枝更纤长（见图2c、f）。无钩羽小枝的羽脉无纤毛和羽小钩，基柄皆有平行排列的深色色素条纹，基柄末端为锯齿状腹齿（见图3）。

2 种鹤类的绒羽微观结构如图4 所示，由节状羽小枝构成，羽小枝竹节状，节间着生纤毛结构。节状羽小枝梢部部纤毛退化，节直径变小，节逐渐不明显，节尖不露出（见图4c、f）；着生纤毛多见不对称纤毛结构（见图4a、d），也可见单侧纤毛（见图4b、e）。

图 2 黑颈鹤和灰鹤有钩羽小枝显微结构特征Fig. 2 The microstructure characteristic of distal barbules from G. nigricollisand G. grus

图 3 黑颈鹤和灰鹤无钩羽小枝显微结构特征Fig. 3 The microstructure characteristic of proximal barbules from G. nigricollisandG. grus

图 4 黑颈鹤和灰鹤节状羽小枝显微结构特征Fig. 4 The microstructure characteristic of nodular barbules from G. nigricollisand G. grus

2.4 羽小枝微观结构特征分析

黑颈鹤和灰鹤类的羽毛微观结构特征分析结果见表2。黑颈鹤有钩羽小枝腹齿数为2～4 枚、纤毛对数4～8 对、羽小钩数为5～8 枚，无钩羽小枝腹齿数4～7 枚。灰鹤有钩羽小枝的腹齿数为2～4 枚、纤毛对数4～8 对、羽小钩数5～9 枚，无钩羽小枝腹齿数4～6 枚。且2 种鹤的有钩羽小枝纤毛对数均呈现呈初级飞羽、次级飞羽、尾羽依次增大的规律（P＜0.05）。

表 2 黑颈鹤和灰鹤羽毛显微结构指标分析Table 2 The statistics on the indexes of microstructure of feathers from G. nigricollisand G. grus

2 种鹤类次级飞羽的有钩羽小枝的腹齿数、纤毛对数、羽小钩数，无钩羽小枝腹齿数均存在显著差异（P＜0.05）；初级飞羽的无钩羽小枝腹齿数、尾羽的有钩羽小枝羽小钩数也均存在明显差异（P＜0.05）。

黑颈鹤绒羽节状羽小枝羽小节间距小于灰鹤，羽小节直径大于灰鹤（P＜0.05）。

2.5 羽毛的特征指标的Fisher 判别分析

以2 种鹤羽毛的形态特征指标为变量，对2 种鹤的归属进行判别分析，一共获得Y1、Y2、Y3、Y4、Y55 个典型判别函数，见表3。在Fisher 判别分析中，判别方程的准确率可用其方差所占的比例来判别。由表4 可知，其Y1、Y2累积方差贡献率为97.7%，可以解释绝大部分样本信息。由此得出以下典型判别函数：

式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分别代表了有钩羽小枝羽小钩数、有钩羽小枝成对纤毛数、有钩羽小枝腹齿数、无钩羽小枝腹齿数、内翈羽枝与羽干夹角、内翈羽枝长、羽片面积和羽片羽轴长这8 个特征指标。

在Wilks 的Lambda 检验中得出2 个函数的显著性水平均小于0.05，即函数Y1、Y2在以羽毛的特征指标为变量，对灰鹤与黑颈鹤的种属判别能力显著（P＜0.05）。利用回代估计法对构建判别函数的数据逐一进行检验，所得的判别方程的正确率为80.2%。

表 3 典型判别函数系数项和常数项Table 3 Coefficient term and constant term of typical discriminant function

3 结论与讨论

本研究对灰鹤与黑颈鹤的初级飞羽、次级飞羽、尾羽和绒羽的羽片外观形态结构与羽小枝的显微结构进行观察，对羽片和羽小枝的形态指标进行了测算和统计分析，积累了鹤属鸟类羽毛微观结构的数据资料；同时以形态特征指标为变量构建了2 个典型的Fisher 函数，研究发现有钩羽小枝羽小钩数、成对纤毛数、腹齿数，无钩羽小枝腹齿数，内翈羽枝与羽干夹角，内翈羽枝长，羽片面积和羽片羽轴长这8 个特征指标均可作为二者鉴别的依据。

野生的鹤属鸟类在形态上很容易识别，本研究中建立的应用羽毛的形态结构特征进行黑颈鹤与灰鹤的物种鉴定方法，主要应用于仅可获取羽毛样本的条件下开展2 种鹤的物种鉴定。在涉及野生鸟类盗猎事件中，羽毛是物种鉴定进行案件侦破的重要线索，目前可见研究者集中于隼形目、鸮形目等鸟类正羽及绒羽的羽小枝的微观结构研究[12,14,16-21]，本研究中所建立的基于羽毛形态结构的物种鉴定方法，将来可应用于海关、森林公安查获案件后送检羽毛样本的物种鉴定。

与已报道量化指标相比[11]，本研究中黑颈鹤初级飞羽的有钩羽小枝呈现出羽小钩数量更多，成对纤毛数更少的特征，这种差异的原因可能为有钩羽小枝的羽小钩数和纤毛数在种内具有可变性，纤毛可发育成为羽小钩。费荣梅等[22]提出，羽小钩数目和纤毛数目之和可能是一个恒定值，提示在羽毛微观形态结构研究中应进一步确认有钩羽小枝的羽小钩数目和纤毛数目之和，探讨其是否可作为鸟类分类的依据。

本研究建立的基于羽毛形态特征的物种鉴别方式，在具有完善的数据库的前提下，具有鉴别耗时短、对设备要求不高的优势，但不足之处在于本研究选用的样本数量和样本种类较少，仅取样了成年个体的羽毛样本，幼鸟的羽毛发育不完整，形态结构特征也不稳定，因此结合分子、化学方式开展幼鸟羽毛的鉴别具有重要意义[23]。鹤类为迁徙动物，云南为黑颈鹤与灰鹤的越冬地[24-25]，本研究中只针对在越冬地的个体，可能会对区分黑颈鹤与灰鹤的羽毛特征产生一定影响。进一步探索年龄、性别、季节、环境对鹤属鸟类的羽毛宏观、微观结构所造成的影响，可为鹤属鸟类的保护与鉴定提供更翔实的基础数据。