刘文豪,尚立辉,王斯文,杨晓莹,程小方,赵继新,邓平川,陈春环,吉万全,王长有

(1.西北农林科技大学农学院,陕西杨凌 712100; 2.农业部作物基因资源与种质创制陕西科学观测实验站,陕西杨凌 712100)

小麦条锈病是由条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麦叶部病害,是中国乃至世界范围内发生最严重的小麦真菌病害之一,可导致小麦减产甚至绝收[1]。培育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、环保、有效的措施,但由于条锈菌致病小种的频繁变异,导致抗条锈病品种的抗病性会在一定时间内丧失[2]。因此,挖掘和培育新的抗条锈病材料对于小麦抗病育种至关重要。

十倍体长穗偃麦草(Thinopyrumponticum(Popd.) Barkworth and Dewey)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)偃麦草属(Elytrigia)的一种多年生小麦近缘种野生植物,起源于欧洲东南部、小亚细亚和俄罗斯南部[3]。研究表明,十倍体长穗偃麦草具有许多优良农艺性状,且高抗小麦条锈病[4]、叶锈病[5]、秆锈病[6]、白粉病[7]、赤霉病[8]等多种病害,是小麦遗传改良的重要三级基因源[9]。目前已有大量携带长穗偃麦草优良性状遗传物质的栽培小麦材料被创制出来,并广泛应用于农业生产中[10-11]。

本课题组从普通小麦7182和十倍体长穗偃麦草的杂交后代中筛选出一个高抗条锈病的衍生系CH18067,本研究利用细胞遗传学、原位杂交、分子标记、芯片检测等技术,结合形态学和条锈病抗性调查,对CH18067进行综合鉴定,以期为小麦条锈病抗性育种提供候选种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料包括十倍体长穗偃麦草(2n=10x=70, EeEbExStSt或JJJJSJS),百萨偃麦草(Thinopyrumbessarabicum, 2n=2x=14, EbEb或JJ),拟鹅观草(Pseudoroegneriaspicata, 2n=2x=14, StSt),普通小麦7182、辉县红和中国春(2n=6x=42, AABBDD),以及普通小麦7182和十倍体长穗偃麦草的F8代衍生系CH18067,以上材料均保存于西北农林科技大学农学院小麦远缘杂交与染色体工程实验室;供试条锈菌CYR32和CYR33混合生理小种由西北农林科技大学植物保护学院提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞学鉴定

分别于3月下旬和4月中旬在田间取CH18067的根尖和幼穗,参照Yang等[12]的方法,根尖采用卡诺氏固定液Ⅰ(V无水乙醇∶V醋酸=3∶1)在室温下固定48 h,幼穗采用卡诺氏固定液Ⅱ(V无水乙醇∶V氯仿∶V醋酸=6∶3∶1)在室温下固定48～72 h,二者均使用1.0%的醋酸洋红进行染色。根尖和幼穗的镜检均在Olympus BX-43相差显微镜下进行,对CH18067体细胞有丝分裂中期Ⅰ染色体的数目、花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体的构型以及减数分裂后期Ⅰ同源染色体的分离情况进行观察和统计。

1.2.2 原位杂交鉴定

染色体制片:将种子浸泡至露白后置于铺有湿润滤纸的培养皿中,于23 ℃恒温培养箱黑暗条件下萌发2～3 d,待幼根长至1.8～3.0 cm时切下,用笑气(N2O)处理2 h,用90%醋酸(v/v)固定根尖10 min以上,然后置于70%酒精(v/v)中,-20 ℃保存。参照Yang等[13]的方法,将经过处理的幼根取出后切下根尖分生区,用1%的果胶酶(v/v)和2%的纤维素酶(v/v)于37 ℃处理 50～60 min(根据材料适度调整处理时间),根尖体细胞的染色体制片采用滴片法。

原位杂交:参照Han等[14]的方法,用寡聚核苷酸探针Oligo-pTa535(红色)和Oligo-pSc119.2(绿色)对CH18067及其后代CA495-2的根尖体细胞染色体进行荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)分析。基因组原位杂交(genomicinsituhybridization, GISH)参照Wang等[15]和Fu等[16]的方法,使用CTAB法提取试验材料幼嫩叶片的全基因组DNA,以Fluorescein-12-dUPT标记的十倍体长穗偃麦草全基因组DNA为探针,以中国春全基因组DNA为封阻(封阻比例为1∶300),对CH18067和CA495-2进行分析;以Fluorescein-12-dUPT(绿色)标记的百萨偃麦草全基因组(J)DNA和Texas red-5-dUPT(红色)标记的拟鹅观草全基因组(St)DNA为探针,以中国春全基因组DNA为封阻,对CH18067进行多色基因组原位杂交(multicolor genomicinsituhybridization, mc-GISH)分析。使用Olympus BX-53荧光显微镜对原位杂交的结果进行镜检,并用Adobe Photoshop CS6处理图像。

1.2.3 分子标记鉴定和液相芯片分析

利用分布于小麦第一至第七部分同源群上的EST、PLUG分子标记和小麦-二倍体长穗偃麦草液相芯片(GenoBaits○RWheatplusEE)对CH18067中的外源染色体同源群归属进行分析。EST引物信息来自网站https://graingenes.org/cgi-bin/GG3/browse.cgi,PLUG引物来自Ishikawa等[17]发表的引物。引物均由北京奥科鼎盛生物技术有限公司合成。PCR和电泳分析按照Zhu等[18]的方法进行。芯片检测由石家庄博瑞迪生物技术公司进行,主要过程为DNA文库制备、探针杂交、Illumina HiSeq X测序、BWA软件比对和R软件包制图。

1.2.4 农艺性状调查和条锈病抗性鉴定

植株收获后,对CH18067及其亲本7182的株高、分蘖数、穗长、小穗数、小穗粒数、粒长和千粒重进行调查和记录。

条锈病的接种鉴定在西北农林科技大学北校区试验田进行,鉴定材料于2021年10月上旬播种,每个材料播种2行,行长1 m,每行播种10粒。于2022年3月中旬,以感病对照辉县红作诱发行,采用撒粉接种法将CYR32和CYR33的混合生理小种均匀地撒在喷湿的小麦植株上,待辉县红充分发病后,调查田间植株发病情况,3～5 d后复查1次。反应型(IT)按照0～4级标准记载[19]:0级为免疫;0;级为近免疫;1 级为高抗;2级为中抗;3级为中感;4级为高感。

2 结果与分析

2.1 细胞学鉴定结果

根尖分生区体细胞染色体数目观察结果(图1a)显示,CH18067的体细胞在有丝分裂中期含有42条染色体。花粉母细胞镜检结果(图1b,图1b)显示,在减数分裂中期Ⅰ,CH18067的染色体构型为2n=42=21Ⅱ,未观察到单价体和多价体,染色体配对良好;在减数分裂后期Ⅰ,同源染色体可以均等分离,未观察到落后染色体和染色体桥。这些结果表明,CH18067是一个细胞学遗传稳定的材料。

a:有丝分裂中期;b:减数分裂中期Ⅰ;c:减数分裂后期Ⅰ。a: Mitotic metaphase; b: Meiotic metaphase Ⅰ; c: Meiotic anaphase Ⅰ.图1 CH18067的细胞学观察结果Fig.1 Cytological observation of CH18067

2.2 原位杂交鉴定结果

根据Tang等[20]和Du等[21]公布的普通小麦中国春和7182的染色体FISH核型,以及Tang等[20]、Jiang等[22]和Wang[23]等公布的1R、1RS/1BL染色体的FISH核型,用寡核苷酸探针Oligo-pTa535(红色)和Oligo-pSc119.2(绿色)对CH18067进行FISH分析,结果可鉴定出CH18067中普通小麦A基因组的7对染色体、B基因组的7对染色体(含一对1RS/1BL易位染色体)以及D基因组中的1D、3D、5D、6D和7D染色体,而D基因组中的2D和4D染色体无法进行准确鉴别(图2a)。同时发现CH18067中有两对染色体显示出特殊的FISH带型,其中一对染色体在长臂和短臂末端显示Oligo-pTa535探针红色带型,另一对染色体在着丝粒位置和长臂末端显示Oligo-pTa535探针红色带型(图2b)。随后以十倍体长穗偃麦草全基因组DNA为探针,以中国春全基因组DNA为封阻对CH18067进行连续FISH-GISH,结果(图2c)显示,两对特殊FISH带型的染色体均能显示出十倍体长穗偃麦草基因组探针杂交信号,说明这两对具有特殊FISH带型的染色体来自于十倍体长穗偃麦草。

a:用Oligo-pTa535(红色)和Oligo-pSc119.2(绿色)探针对CH18067进行FISH;b:CH18067的FISH核型图;c:以十倍体长穗偃麦草全基因组DNA(绿色)为探针对CH18067进行FISH-GISH;d:以百萨偃麦草全基因组DNA(绿色)和拟鹅观草全基因组DNA(红色)为探针对CH18067进行mc-GISH。白色箭头指示外源染色体,红色箭头指示1RS/1BL染色体。a: FISH of CH18067 with Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green) probes; b: FISH karyotype of CH18067; c: FISH-GISH of CH18067 with whole genome DNA(green) of Th.ponticum as probe; d: mc-GISH of CH18067 with genomic DNA of Th.bessarabicum(green) and Ps.strigosa (red) as probes. White arrows refer to the alien chromosome, and red arrows refer to the 1RS/1BL chromosome.图2 CH18067的原位杂交鉴定结果Fig.2 In situ hybridization identification of CH18067

进一步以Fluorescein-12-dUPT(绿色)标记的百萨偃麦草全基因组(J)DNA和Texas red-5-dUPT标记(红色)的拟鹅观草全基因组(St)DNA为探针,以中国春全基因组DNA为封阻,对CH18067进行mc-GISH。结果(图2d)显示,CH18067中有一对染色体全部呈现出明亮的绿色杂交信号,该信号符合J基因组染色体特征;另一对染色体在短臂和长臂末端上显示出绿色杂交信号,且在着丝粒位置显示出较强的红色杂交信号,符合JS基因组染色体的特征,表明CH18067中含有一对J基因组染色体和一对JS基因组染色体。结合FISH结果(图2a),推断CH18067中的2D染色体和4D染色体分别被十倍体长穗偃麦草的一对J染色体和一对JS染色体所代换。

2.3 芯片分析结果

二倍体长穗偃麦草E(Ee)基因组与百萨偃麦草J(Eb)基因组的同源性较高[23],二者普遍被认为是十倍体长穗偃麦草的供体基因组[12],因此采用小麦-二倍体长穗偃麦草GenoBaits○RWheatplusEE液相芯片对CH18067进行检测。结果(图3)显示,CH18067中普通小麦的2D和4D染色体上的检测信号很弱,而在二倍体长穗偃麦草的2E和4E染色体上信号显著富集,且4E染色体上长臂和短臂端部的信号比较密集,着丝粒位置附近信号较弱。在CH18067的mc-GISH鉴定中,有一对染色体整体呈现绿色杂交信号,芯片检测结果则显示2E染色体上信号分布均匀,因此推断其为2J染色体;另外一对染色体在短臂和长臂末端显示出绿色信号,以及在着丝粒位置附近显示出红色信号,而芯片检测结果则发现4E染色体的短臂和长臂末端显示出密集信号,以及着丝粒位置附近显示出微弱信号,由此推断其为4JS染色体。根据Tang等[20]和Du等[21]公布的普通小麦中国春和7182的染色体核型,参考李懋学等[24]的方法对染色体的核型进行进一步FISH鉴定,发现CH18067中在长臂和短臂末端显示Oligo-pTa535红色带型的是2J染色体,在着丝粒位置和长臂末端显示Oligo-pTa535红色带型的是4JS染色体(图2b)。此外,在芯片检测结果中,还发现CH18067中普通小麦的1B染色体短臂上信号缺失,这与FISH鉴定观察到其含有1RS/1BL易位染色体的情况相吻合。因此,CH18067中普通小麦的2D和4D染色体分别被十倍体长穗偃麦草的2J和4JS染色体所代换,其为小麦-十倍体长穗偃麦草2J(2D)+4JS(4D)双重异代换系。

2.4 分子标记分析结果

利用57对EST引物和21对PLUG引物对CH18067及其亲本7182、十倍体长穗偃麦草进行分子标记分析,最终筛选出5个PLUG标记和1个EST标记(表1),且在CH18067和十倍体长穗偃麦草中均扩增出特异性条带(图4)。其中,3个PLUG标记位于小麦第二部分同源群染色体上,2个PLUG和1个EST标记位于小麦第四部分同源群染色体上,验证了GenoBaits○RWheatplusEE芯片的分析结果。

表1 CH18067携带的十倍体长穗偃麦草2J和4JS染色体连锁的EST和PLUG多态性标记Table 1 EST and PLUG polymorphic markers linked to 2J and 4JS chromosomes from Th. ponticum carried by CH18067

M:DL2000;1:7182;2:CH18067;3:十倍体长穗偃麦草;a:TNAC1210-HaeⅢ;b:TNAC1140-Taq Ⅰ;c:TNAC1182-Hae Ⅲ;d:TANC1663-HAE Ⅲ;e:TANC1421-HAE Ⅲ;f:BG606980。箭头所指为特异性条带。M: DL2000; 1: 7182; 2: CH18067; 3: Th. ponticum; a: TNAC1210-Hae Ⅲ; b: TNAC1140-Taq Ⅰ; c: TNAC1182-Hae Ⅲ; d: TANC1663-HAE Ⅲ; e: TANC1421-HAE Ⅲ; f: BG606980. Arrows indicate specific bands.图4 CH18067的多态性标记分析结果Fig.4 Polymorphic marker analysis of CH18067

2.5 CH18067的农艺性状和条锈病抗性评价

CH18067及其亲本7182的农艺性状调查结果(图5,表2)显示,CH18067的株高、分蘖数和千粒重均显著低于亲本7182,而粒长则显著大于7182,在穗长、小穗数和小穗粒数方面二者无显著差异。成株期条锈病抗性鉴定结果(图6)显示,感病对照品种辉县红表现为高感(IT=4),亲本7182表现为中感(IT=3),十倍体长穗偃麦草表现为免疫(IT=0),CH18067表现为高抗(IT=1)。根据抗病性鉴定结果以及系谱分析,推测CH18067成株期的条锈病抗性来源于其所携带的十倍体长穗偃麦草染色体。

表2 CH18067与7182的农艺性状比较Table 2 Comparison of agronomic traits between CH18067 and its parent 7182

a:植株;b:穗子;c:小穗和籽粒;1:7182;2:CH18067。a: Plant; b: Spike; c: Spikelet and grain; 1: 7182; 2: CH18067.图5 CH18067及其亲本7182的农艺性状表型Fig.5 Agronomic traits phenotype of CH18067 and its parent 7182

1:7182;2:CH18067;3:辉县红;4:十倍体长穗偃麦草。1: 7182; 2: CH18067; 3: Huixianhong; 4:Thinopyrum ponticum.图6 CH18067及其亲本的成株期条锈病抗性表现Fig.6 Stripe rust resistance at adult stage of CH18067 and its parents

3 讨论

目前,关于十倍体长穗偃麦草的基因组组成尚无统一结论。Zhang等[25]认为E(Ee和Eb)基因组和St基因组是十倍体长穗偃麦草的两个基本基因组,十倍体长穗偃麦草的基因组组成为StStEeEbEx;Chen等[26]认为十倍体长穗偃麦草中不含有完整的St基因组,十倍体长穗偃麦草的基因组组成为JJJJSJS,JS基因组是在着丝粒附近区域含有St染色体组DNA序列的J组染色体。Liu等[27]研究表明,十倍体长穗偃麦草的St基因组和E(Ee和Eb)基因组与普通小麦的D基因组关系密切,并认为这是小麦-偃麦草D基因组频繁发生代换和易位事件的原因。本研究中CH18067也是D基因组染色体与十倍体长穗偃麦草基因组染色体之间发生了双重代换。

本研究通过GISH技术,精确鉴定出CH18067含有来自十倍体长穗偃麦草的染色体,用FISH-GISH技术在同一染色体制片上将外源染色体的FISH信号与GISH信号相对应,并结合液相芯片和分子标记的分析结果,明确了十倍体长穗偃麦草的2J和4JS染色体与Oligo-pTa535探针所形成的杂交信号,为今后揭示十倍体长穗偃麦草染色体FISH核型奠定了基础。此外,本研究筛选获得了5个PLUG标记和1个EST标记,在CH18067和十倍体长穗偃麦草中均扩增出特异性条带,其中3个PLUG标记归属于小麦第二部分同源群,1个EST和2个PLUG标记归属于小麦第四部分同源群,这些标记可用于小麦遗传背景下十倍体长穗偃麦草2J与4JS染色体的检测与追踪。

条锈病严重威胁小麦安全生产。本研究中CH18067在成株期对条锈菌CYR32和CYR33的混合小种表现为高抗。CH18067含有1RS/1BL易位染色体,可能是其在育种过程中发生了异交授粉所致,1RS染色体虽携带抗条锈病基因,但其抗病性早已丧失。结合CH18067亲本的抗病性鉴定,推测CH18067在成株期对条锈病的抗性来源于其携带的十倍体长穗偃麦草染色体,但由于其同时携带了十倍体长穗偃麦草的2J和4JS染色体,因此暂时无法确定其条锈病抗性的具体染色体。

小麦异代换系在小麦亲缘种的基因定位、外源染色体在小麦背景下的遗传分析、小麦及其亲缘种间的进化研究等方面均具有十分重要的作用,也可作为桥梁材料进一步向小麦转移外源有益基因,在小麦育种中具有巨大的应用潜力。国内外小麦遗传育种学家已创制出大量的普通小麦及其近缘种的异代换系,将抗小麦锈病、白粉病、赤霉病的基因转移到了普通小麦中,但由于外源染色体通常补偿能力较差或携带不良基因,通常导致异代换系在小麦生产中不能直接应用。因此,CH18067可以作为中间材料,进一步利用电离辐射、杀配子效应等手段,创制出含有抗条锈病基因的渐渗系或小片段易位系新种质,以用于抗条锈病小麦育种工作。