吴燕如 赵婉彬 于俊岩

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，在全球癌症中发病率居第6 位，死亡率居第3 位[1]。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）作为肝癌的主要组织学类型，占肝癌诊断和死亡的绝大多数[2]。近年来HCC 的诊断和治疗虽取得了许多进展，但患者的生存率仍然很低[3]。因此，寻找HCC 的生物标志物帮助指导个体化预后和治疗至关重要。

铜死亡（Cuprotosis）是2022 年3 月由Tsvetkov等[4]提出的一种新型细胞死亡方式，由铜离子与三羧酸循环脂化组分的直接结合所介导。这一结合导致脂酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白丢失，进而导致蛋白质毒性应激，最终诱导细胞死亡，为肿瘤治疗提供了新思路。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度>200 个核苷酸且一般不具备蛋白编码能力的 RNA 分子。lncRNA 在表观遗传修饰、转录及转录后水平调节基因表达[5]。研究显示，lncRNA在HCC 的发生发展中起着至关重要的作用[6]。但铜死亡相关lncRNA 在HCC 中的作用尚不清楚。本研究基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，通过Cox 回归和LASSO 分析构建铜死亡相关lncRNA 预后风险模型并对其预测效能进行评估。

1 材料与方法

1.1 数据下载与处理从TCGA 数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载HCC 转录组、基因突变和相应的临床信息数据并整理，根据人类基因注释文件提取lncRNA。

1.2 铜死亡相关lncRNA 的筛选通过文献检索获得19 个铜死亡相关基因[4，7～9]，采用Pearson 相关性分析筛选铜死亡相关lncRNA（Pearson 相关系数>0.4，P<0.001）。

1.3 构建预后风险模型及评估采用 R 软件“caret”包将样本按1:1 分为训练集和验证集。在训练集中采用Cox 回归分析和LASSO 回归构建预后风险模型。风险评分公式如下：

β 表示回归系数，Exp 表示lncRNA 表达水平，n 为参与模型构建的lncRNA 数量。根据风险评分的中位值，将训练集和验证集患者分为高、低风险组，采用R 软件“survival”包绘制Kaplan-Meier 生存曲线，“survival ROC”包绘制受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve，ROC），计算曲线下面积（Area under curve，AUC）。使用R 软件“scatterplot3d”包绘制主成分分析（Principal component analysis，PCA）图评估高、低风险组之间的潜在差异。

1.4 构建列线图将临床病理特征与风险评分纳入单因素和多因素Cox 回归分析，评估影响HCC 患者预后的独立因素。使用R 软件构建列线图，预测和分析HCC 患者1、3、5 年生存率。校正曲线用于检验列线图的准确性。

1.5 功能富集分析采用 R 软件“ limma”包，以|log2FC|>1，FDR<0.05 为标准，筛选高、低风险组差异表达基因并绘制热图。使用“clusterProfiler”包进行基因本体论（Gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。基于单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）对免疫细胞的浸润及功能进行评估。

1.6 计算肿瘤突变负荷（Tumor mutational burden，TMB）评分使用R 软件“maftools”包对基因突变数据进行分析绘制瀑布图。“ limma”、“ggpubr”包用于绘制高、低风险组小提琴图。根据中位截断值将HCC 患者分为高、低TMB 组，使用“survival”包绘制生存曲线。

1.7 统计学分析采用R 软件4.2.1 进行Pearson 相关性分析、Cox 回归、LASSO 回归、Kaplan-Meier曲线分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用Wilcoxon 秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 铜死亡相关lncRNA 的鉴定从374 例HCC 组织样本和50 例正常肝脏组织样本RNA 测序数据中提取出16 773 个lncRNA，通过共表达分析获取381 个铜死亡相关lncRNA，见图1。

图1 铜死亡相关基因与铜死亡相关lncRNA 桑基图

2.2 构建铜死亡相关lncRNA 预后风险模型及评估将370 例有完整信息的样本分为训练集（185 例）和验证集（185 例），χ2检验结果显示两组间一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。在训练集中行单因素Cox 回归分析获得41 个显著影响预后的铜死亡相关lncRNA（图2A），纳入LASSO 回归筛选出16 个lncRNA（图2B），多 因素Cox 回归分析进一步确定7 个基因构建风险模型，其中AC105020.1、CHASERR 是HCC 患者预后保护因素，FOXD2-AS1、MIR4435-2HG、NRAV、RNF216P1、SNHG3 是预后危险因素。根据风险评分中位值将训练集和验证集患者分为高、低风险组，生存相关图形（图3）显示高风险组HCC 患者的预后较低风险组差（P<0.05）。ROC 曲线结果显示训练集（图4A）1、3、5 年的AUC 值分别为0.819、0.822、0.814，验证集（图4B）AUC 值为0.737、0.651、0.659。整个测试集中风险评分的AUC 值最高，提示风险模型较临床病理特征可更好地预测HCC 患者预后（图4C）。PCA 图显示所有基因（图4D）、铜死亡相关基因（图4E）、铜死亡相关lncRNA 的表达（图4F）均未能区分出高、低风险组的差异。HCC患者根据参与模型构建的7 个铜死亡相关lncRNA的表达情况被分为两个不同的集群（图4G）。

表1 训练集和验证集HCC 患者的临床特征[n（%）]

图2 7 个铜死亡相关lncRNA 的筛选

图3 训练集和验证集高、低风险组生存相关图形

图4 ROC 曲线及PCA 图

2.3 筛选HCC 患者预后独立危险因素单因素和多因素Cox 回归分析（图5A、图5B）结果显示，风险评分和病理分期为影响HCC 患者预后的独立危险因素（P<0.05）。结合临床病理特征和风险评分建立列线图（图5C）预测HCC 患者1、3、5 年的生存率。校正曲线（图5D）证实了预后模型的预测能力。

图5 风险模型验证

2.4 GO 富集分析、KEGG 信号通路分析及免疫功能分析对高、低风险组基因表达进行分析，筛选出482 个差异表达基因。GO 富集分析结果显示，差异表达基因主要涉及细胞器裂变、核分裂、有丝分裂等生物学过程，主要富集的细胞成分包括染色体、纺锤体、凝聚染色体，分子功能主要富集在微管结合、血红素结合、四吡咯结合（图6A）。KEGG 信号通路分析结果显示差异表达基因主要参与细胞周期、细胞衰老、卵母细胞减数分裂等通路（图6B）。免疫功能分析（图6C）结果显示，树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、调节性T 细胞、Ⅱ型干扰素和MHC Ⅰ类在高、低风险组中差异有统计学意义，表明铜死亡可能与肿瘤免疫有关。

图6 功能富集分析

2.5 评估高、低风险组TMB 整理HCC 患者基因突变数据，计算TMB 评分。图7A 所示高风险组突变负荷比低风险组高。瀑布图（图7B、图7C）结果显示高、低风险组突变率分别为85.95%、76.14%，突变频率最高的基因分别为TP53、CTNNB1。高、低TMB 组生存曲线结果显示高TMB 组患者生存率低（图7D）。联合生存分析结果显示TMB 和风险评分对HCC 患者生存期有显著影响（图7E）。

图7 TMB 分析

3 讨论

铜死亡是新发现的一种程序性细胞死亡方式，参与肿瘤的发生和进展。lncRNA 可在癌症发展过程中调节细胞增殖、凋亡、侵袭、转移及代谢，参与重塑肿瘤微环境[10]。目前很少有研究探索铜死亡相关lncRNA 在HCC 中的作用。

本研究中，首先我们通过共表达分析得到与铜死亡相关的lncRNA，并进行单因素和多因素 Cox回归分析及LASSO 回归分析，建立了铜死亡相关lncRNA 预后风险模型。然后，通过生存分析、ROC曲线、PCA 图评估了该模型的准确性，结果显示高风险组患者具有更差的预后，该模型可以有效预测HCC 患者1、3、5 年生存率，AUC 值均大于0.65。PCA 图直观地显示了高、低风险组之间的差异。随后，采用单因素和多因素Cox 回归分析进一步探讨了临床病理特征和风险评分对HCC 预后的影响，结果显示风险评分、病理分期是HCC 的独立预后因素。另外，利用列线图构建个体化预后预测模型，校准曲线显示实际和预测的生存期高度一致。基于上述结果，我们认为本研究中构建的预后风险模型是HCC 患者有效的预后指标。此外，为了探索差异表达基因的潜在作用机制，我们进行了功能富集分析。GO 和KEGG 分析表明，这些差异基因主要富集在细胞周期、细胞衰老中。免疫功能分析结果显示，在高、低风险组中树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、调节性T 细胞、Ⅱ型干扰素和MHC Ⅰ类差异有统计学意义，表明铜死亡可能与肿瘤免疫有关。最后，通过对基因突变数据进行分析发现高风险组TMB 高于低风险组，提示免疫治疗可能对HCC 高风险组患者更有益。

纳入模型的7 个lncRNA 中大部分已被证实与HCC 的进展相关。文献报道，FOXD2-AS1 通过调控miR-206/MAP3K1 轴、miR-185/AKT 轴从而促进HCC 的进展[11，12]。MIR4435-2HG 可以上调B3GNT5、miRNA-487a 的表达进而诱导肝癌的发生[13，14]。NRAV 通过靶向miR-199a-3p 调控CISD2 进而激活Wnt/β-catenin 信号通路，从而导致肝癌细胞增殖和侵袭[15]。SNHG3 过表达可以促进HCC 的增殖、迁移和上皮-间质转化，通过miR-326/SMAD3/ZEB1轴促进肝细胞肿瘤的进展[16]。我们的研究结果显示，FOXD2-AS1、MIR4435-2HG、NRAV、SNHG3在高风险组中高表达，与HCC 患者生存状态差有关，这与以往研究结果一致。另有文献报道，CHASERR 的缺失使CHD2 mRNA 和蛋白质水平大幅增加，进而通过抑制高表达基因下游的启动子导致转录干扰，影响小鼠存活时间[17]。本研究中CHASERR 作为低风险基因，有利于HCC 患者预后，其作用机制有待进一步研究。

综上，本研究构建了一个包含7 个铜死亡相关lncRNA 的预后模型，具有良好的预测效能，Cox 回归分析结果显示，风险评分与病理分期是HCC 患者预后的独立危险因素，为HCC 患者个体化治疗提供参考。本研究有一定的局限性，该风险模型是基于公开数据库创建的，且在同一个数据库中进行验证，缺乏新的临床样本和数据，需在临床试验中进一步验证。